靳克儉

·臨床案例·

乙型肝炎病毒檢測罕見模式1例

靳克儉

采用ELISA及化學發(fā)光法檢測乙型肝炎病毒五種血清標志物, 在本肝病?？茖嶒炇覚z測過程中, 發(fā)現(xiàn)一例未經(jīng)報道的罕見病例模式(－＋＋－＋), 其檢測結果具有明顯特殊性, 本文就此病例進行探討, 試圖討論其機制機理, 以期引起相關專業(yè)工作者的注意, 提高檢測準確性, 并為病毒基因復制的深入研究提供參考。

乙型肝炎病毒血清標志物模式是目前肝炎病毒診斷和臨床分析的重要依據(jù), 隨著乙型肝炎病毒治療水平的不斷提高,治療和用藥的不同, 隨著病毒的變異, 也使HBV血清學模式呈現(xiàn)了多樣性, 使臨床醫(yī)生對HBV血清標志物報告的分析和解釋越來越難, 從而影響診療。近期蘭州市第二人民醫(yī)院肝病專科實驗室又發(fā)現(xiàn)一例為HBsAg陰性、HBsAb陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、HBcAb陽性的罕見模式。與常見模式及所報道罕見模式［1］不同。

1 儀器及試劑

1.1 儀器 美國ABI7300PCR擴增儀、采用美國ABI3130測序儀、科華ST-360酶標儀。

1.2 試劑 HBV ELISA定性檢測用英科新創(chuàng)(夏門)科技有限公司試劑盒、HBV化學發(fā)光定量檢測用上?？迫A生物工程有限公司試劑盒、HBV核酸擴增(PCR)熒光定量檢測乙肝病毒DNA用上?？迫A生物工程有限公司試劑盒、S區(qū)測序提取用星耀醫(yī)學科技發(fā)展有限公司的HBV乙肝核酸定量檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 血清學檢測采用ELISA法及化學發(fā)光法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb五種血清學標志物。

1.3.2 HBV DNA定量檢測采用HBV核酸擴增(PCR)熒光定量檢測乙肝病毒DNA。

1.3.3 基因測序采用PCR結合DNA測序?qū)BV S區(qū)基因

進行多態(tài)性檢測,并應用Chromas軟件進行比對和分析

2 結果

2.1 ELISA不同時間段檢測同一患者三次采血樣本結果均為HBsAg陰性、HBsAb陽性、HBeAg陽性、HBeAb陰性、HBcAb陽性?；瘜W發(fā)光法檢測結果HBsAg <0.01 (ng/ml)、HBsAb 147(mIU/ml)、HBeAg 2.24 ( ncu/ml)、HBeAb<0.01(ncu/ ml)、HBcAb13.2 (ncu/ml)。

2.2 HBV DNA檢測結果2.89×106 copies/ml,為中度復制。

2.3 S1區(qū)變異位點:2526T/A,2530A/C,2557A/G,2563G/A, 2572A/ C, 2620G/A,2636T/A, 2680G/A,2677C/A,2683C/T,2700G/ T,2713T/C,2716G/A,2766C/T,2793A/C,2876A/G,2896T/ A,2942C/T,2946G/A,2950G/A,2999A/C,3000C/A.

S2區(qū)變異位點:160G/A,195T/C,196G/A,293C/A,356C/T, 585A/ G,747C/A,723T/C,734C/T, 833G/A,839T/C,885A/G,954T/C.

3 結論

前S1區(qū)突變主要發(fā)生在后半段；前S2區(qū)nt585突變, 導致HBsAg第145 位甘氨酸被精氨酸取代,顯著降低了HBsAg的抗原性, 使之不能與單克隆抗“A”抗體及疫苗接種后抗體或恢復期血清抗體結合或者結合力下降, 從而產(chǎn)生免疫逃避株而感染患者。

4 討論

HBV基因組全長約3200 bp, 是部分雙鏈的環(huán)狀DNA, 其負鏈核苷酸序列有4個相互重疊的開放讀碼框(ORF), 分別為S、C、P和X區(qū)。HBV自身編碼的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能, 可由前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄合成子代病毒基因組, 但逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3'-5'的校對功能, 造成子代HBV基因組與模板之間存在一定的差異, 在復制過程中極易產(chǎn)生突變, 理論上來說,一個乙肝感染患者可以每天出現(xiàn)多達1010-11次突變(10-5RT突變率/bp/病毒/d×3200bpHBV基因組×1012-13病毒/d［2,3］)。HBsAg由S區(qū)基因編碼, 其優(yōu)勢共同抗原表位“A”決定簇位于高度保守的124~147位氨基酸親水區(qū), 是HBV各血清亞型的共同決定簇, 在所有血清亞型中均存在。“A”決定簇借2對二硫鍵形成2個環(huán)狀結構,其獨特的空間構象使其具有極強的抗原性, 機體產(chǎn)生的保護性抗體中90%以上針對“A”決定簇, 該部位氨基酸的替代造成的蛋白結構改變是HBsAg抗原性漂移產(chǎn)生的分子基礎?？乖肿拥牧Ⅲw結構是決定抗原與淋巴細胞抗原受體結合引起免疫應答的關鍵, 也是決定抗原與抗體結合出現(xiàn)各種免疫反應的物質(zhì)基礎。若抗原立體結構發(fā)生改變, 可使抗原性改變或喪失HBsAg蛋白結構中發(fā)生氨基酸替代后,一級結構發(fā)生改變, 導致維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級空間結構的各種氨基酸側鏈之間的作用平衡被打破,而形成新的平衡和空間構象。HBsAg突變主要出現(xiàn)在乙肝病毒S蛋白的“A”決定簇(124 -148a·a)?！癆”決定簇有兩個通過二硫化鍵相連的環(huán)狀結構。在“A”決定簇中, HBsAg主要的突變出現(xiàn)在141-145a·a間,其中gly-145-arg報道的最多［4-7］。

本文中病例的a突變與上述報道相符。由于氨基酸側鏈結構的不同,甘胺酸(glycine)到精氨酸(arginine)的突變改變了“A”決定簇中腔結構的空間,而這一部位是抗原和抗體結合的十分重要的位點。由于HBV的診斷和篩查試劑都是基于抗原和抗體結合的機制,而突變株會影響抗原和抗體間的結合,并最終影響到試劑的性能。

因條件有限, 本文未對該病例運用更多的檢測手段(如雅培珠法)進行更深入的檢測, 這是本文的不足之處。在今后的工作中我們應對HBsAg突變的具體機制進行更深入的探究, 為臨床對乙型肝炎相關疾病進行準確和及時的診治提供有價值的信息。

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Using ELISA and chemiluminensense to detecting HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb, during the testing of these five biomarkers in serum.We have discovered a rare pattern, his detecting results(-＋＋－＋)are uncommon and never reported before; we are discussing this pattern in the article, trying to drawing other researchers attention and make it out.Also hope to enhance the accuracy of detection.

HBV; Uncommon pattern; Gene reproduction

730046 蘭州市第二人民醫(yī)院肝病研究所

【關鍵詞】乙肝；罕見模型；基因復制

A rare pattern in hepatitis b virus detecting JIN Ke-jian.The NO.2 People's Hospital of Lanzhou 730046,China