王京 沈定霞

眾所周知，TNF可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在這一過程中，NF-κB會(huì)被激活，同時(shí)還可抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生的凋亡[1-3]。細(xì)胞可以通過NF-κB這一通路產(chǎn)生抗凋亡效用和起到轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的作用。NF-κB的研究日漸增多，其中在TNF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中的作用逐漸被重視。

1 NF-κB的定義

核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor）是一種能與啟動(dòng)子區(qū)的固定核酸序列結(jié)合從而激活基因的轉(zhuǎn)錄功能的特殊蛋白質(zhì)。有一種核蛋白因子，能特異結(jié)合免疫球蛋白κ鏈基因上GGGACTTTCC這一增強(qiáng)子序列，然后促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)κ輕鏈，這種蛋白質(zhì)最早發(fā)現(xiàn)于B細(xì)胞的核提取物中，所以被稱做NF-κB。目前，將其歸為NF-κB/ReL蛋白家族成員，此家族成員目前包括以下幾類：（1）p50及其前體p105 （NF-κB1）；（2）p52及其前體p100 （NF-κB2）；（3）C-Rel；（4）P65 （RelA）和（5）RelB。此家族成員均包含一個(gè)氨基末端，包括DNA結(jié)合部位、二聚體化部位以及和IκB 結(jié)合的位點(diǎn) -NLS（nuclear translocation signal），主要負(fù)責(zé)形成二聚體，與DNA以及抑制蛋白IκB結(jié)合，此氨基末端來源非常保守，由300個(gè)左右氨基酸組成，稱為Rel同源 區(qū)（rel homology domain，RHD） 或 NRD（NF-κB/ReL/dorsal）， RHD含有的NLS定位序列可以促使活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核而實(shí)現(xiàn)本身的功能。NF-κB二聚體與DNA結(jié)合后，可形成一個(gè)有活性的結(jié)構(gòu)。NF-κB/ReL蛋白大家族各成員之間可以形成同源的或異源二聚體，而這些蛋白二聚體不同的組成結(jié)構(gòu)的結(jié)合序列也不相同，而且各自具有各自的特性，DNA靶目標(biāo)的細(xì)微不同都可以被NF-κB二聚體的不同形式識(shí)別出來，從而使得面對(duì)不同的調(diào)節(jié)對(duì)象基因或序列時(shí)，NF-κB的不同亞單位形式的表達(dá)能力得到相應(yīng)的保證。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，功能性NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)在諸如IL22、IL26、IL28、TNF、TNFβ、ICAM21、GM2CSF等許多基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上都具備了[4]。比如P50與P65這一二聚體結(jié)合的序列為5′ GGGRNNYYCC3′，此為NF-κB的標(biāo)準(zhǔn)形式； 5′ HGGARNYYCC3′這一序列則是 RelA/C-Rel二聚體的結(jié)合序列，其中R為嘌呤，Y為嘧啶，H代表A、C或T。在眾多的NF-κB蛋白形式中，是負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄的NF-κB復(fù)合體形式為P50/P65、P50/C-ReL、P65/C-ReL，而負(fù)責(zé)抑制轉(zhuǎn)錄的復(fù)合體形式是P50同源二聚體和P52同源二聚體。

2 NF-κB被激活的途徑及其與TNF之間的聯(lián)系

NF-κB在非激活條件下，以一種無活性形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)。此時(shí)NF-κB與NF-κB的抑制蛋白形成一種復(fù)合物。NF-κB是一種可被誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其結(jié)合位點(diǎn)可以接受到種類繁多的免疫刺激，這其中常見的有病毒感染、T細(xì)胞激活劑、生長(zhǎng)因子、IL21、LPS以及TNF等，這些因素均可輕松激活NF-κB[5]。IκB家族成員有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ等，均為抑制NF-κB主要的蛋白。該家族擁有5～7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和C端PEST序列，錨蛋白重復(fù)序列與Rel蛋白相互作用，C端PEST序列和降解密切相關(guān)。NF-κB的核定位信號(hào)一般被IκB所掩蓋，以無活性的形式在胞漿中被IκB滯留[6]。目前的研究以IκBα居多且詳細(xì)深入，NF-κB的主要調(diào)控抑制蛋白就是IκBα，與它之具備有高親和力的主要是含有RelA和C-Rel的二聚體，其他Rel與它的親和力相對(duì)低很多。NF-κB/ReL的Rel同源區(qū)的氨基酸殘基主要與它發(fā)生相互作用，從而掩蓋了IκB結(jié)合的位點(diǎn)NLS，抑制了核易位使NF-κB滯留于胞漿。IκBα、IκBγ和IκBδ可與Rel蛋白中p50的前體p105以及p52的前體p100作用，因?yàn)槠涞鞍證端擁有錨蛋白重復(fù)序列，可經(jīng)此重復(fù)序列與ReL蛋白N末端RHD產(chǎn)生二聚體化從而滯留在細(xì)胞漿。當(dāng)胞外產(chǎn)生一個(gè)諸如TNF結(jié)合等的刺激以后，刺激再通過一或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑，激活了蛋白激酶，作用于原來以失活形式存在于胞漿中的NF-κB三聚體復(fù)合物，使其中的IκBα磷酸化，三聚體發(fā)生解離，IκBα游離出來，與泛素結(jié)合，變成泛素化的IκBα，其再被蛋白酶小體降解，最終使得二聚體NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位[7]。此外還有一類IκB蛋白，即BCL-3，是跟獨(dú)特的NF-κB二聚體產(chǎn)生交互作用，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。BCL-3為一新發(fā)現(xiàn)蛋白，其位于細(xì)胞核，協(xié)同P50或P52同源二聚體發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄作用，而非抑制核易位或抑制DNA結(jié)合作用。不過BCL-3不能與P50的NLS區(qū)域結(jié)合[8]，這一結(jié)果與NF-κB和IκBα的相互作用是相反的。

目前，對(duì)激活NF-κB機(jī)制的研究逐漸透徹，已發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)抗凋亡基因被NF-κB上調(diào)，而且現(xiàn)在對(duì)于NF-kB如何被各種細(xì)胞外誘導(dǎo)因素激活，和激活后信號(hào)如何傳導(dǎo)到下游，以及各傳導(dǎo)通路的共同交匯點(diǎn)已一些相對(duì)基本的常識(shí)。NF-κB的活化一般分成3條通路：（1）生存因子先與TRADD聚集，然后TRADD再與TRAF2結(jié)合，從而活化NIK（NF-κB inducing kinase，NF-κB誘導(dǎo)因子），NIK進(jìn)一步活化IKκB復(fù)合物，使IκB迅速磷酸化，泛素化降解，釋放NF-κB迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位。而酪氨酸激酶可能在TRAF2活化NF-κB的過程中起重要作用[9]。（2）受體酪氨酸激酶（RTK）被生存因子信號(hào)激活，進(jìn)而活化RAS-MEK信號(hào)通路，通過受體相互作用蛋白（RIP）MEK參與NIK的活化，最后促進(jìn)NF-κB活化。此通路需要在shc/sos參與下。（3）PI3K被生存信號(hào)激活后，AKT使IκB磷酸化，致使其從NF-κB上分離，使NF-κB活化。AKT抑制劑可抑制NF-κB的活化。不同的刺激因素，活化NF-κB可能具有不同的通路，IκB的磷酸化即是各不同通路之間的共同點(diǎn)。如IL-1，TNF及LPS等典型的刺激炎癥因子促使IkBα等IkBs產(chǎn)生磷酸化和降解的過程一般發(fā)生在數(shù)分鐘以內(nèi)。最初IkBα由激酶復(fù)合物IKK作用，在Ser32和Ser36兩個(gè)位點(diǎn)[9-10]上發(fā)生磷酸化。IkBα磷酸化以后，迅速在分子中的Lys21及Lys22兩個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生泛素化[11-12]，這一過程由泛素連接酶復(fù)合物SCF（Skp-1/Cul/F-box）大家族成員中一個(gè)E3RSIkB/b-TrCP識(shí)別[13]。26S蛋白酶體能夠識(shí)別泛素化的IkBα分子，并迅速降解之。IkBα降解以后，NF-κB即能從三聚體復(fù)合體中被釋放和活化，活化的NF-kB暴露出其核定位序列來，然后即能迅速轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能。IKK復(fù)合物是由兩個(gè)活性亞基IKKα和IKKβ以及一個(gè)調(diào)節(jié)性亞基IKKγ共同組成。Knockout實(shí)驗(yàn)證明，IKKβ和IKKγ也是NF-kB被炎癥因子激活過程中不可缺少的成分。

活化的NF-κB發(fā)揮啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能后，將作用于各種特異的靶基因，誘導(dǎo)這些靶基因的表達(dá)，編碼不同的前炎性蛋白質(zhì)，諸如生長(zhǎng)因子，IFN，細(xì)胞因子，細(xì)胞粘附因子等，誘導(dǎo)C-IAH，C-IAP2等凋亡抑制蛋白的基因表達(dá)，抑制一氧化氮合酶NOS的生成，誘導(dǎo)Bcl-x1，Bcl-2這些抗凋亡基因的表達(dá)。于細(xì)胞內(nèi)外均可發(fā)生針對(duì)NF-κB的反饋調(diào)節(jié)，NF-κB的活化能夠增加TNF、IL-1β等的轉(zhuǎn)錄水平，并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又可以反過來繼續(xù)活化NF-κB。這就是通過細(xì)胞外機(jī)制放大刺激信號(hào)的正反饋。IκBα、p105基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)是對(duì)NF-κB的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化，水平提高，會(huì)對(duì)此二基因上有作用，因?yàn)槎呓Y(jié)構(gòu)中均含有NF-κB的作用位點(diǎn)。P50二聚體隨著p105的增加而增加，因?yàn)閜50二聚體缺乏轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域且不能與IκB有效結(jié)合，還可以通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NF-κB結(jié)合位點(diǎn)來減少其他Rel蛋白與NF-κB的結(jié)合并抑制NF-κB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，P50二聚體可以降低NF-κB的介導(dǎo)效果。這就是負(fù)反饋之一。此外負(fù)反饋也可由反向細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)，這是細(xì)胞外刺激如IL-10、TNF或者IL-1等產(chǎn)生的。IL-10抑制NF-κB活化的過程是通過抑制內(nèi)毒素實(shí)現(xiàn)的，也可達(dá)到抑制NF-κB進(jìn)而降低某種細(xì)胞因子產(chǎn)生的效果[8]。

TNF-α與TNF-R1的結(jié)合能夠激活PC-specific phospholipase C （PC-PLC），然后產(chǎn)生1，2二?；视停?，2DAGs），1，2二酰基甘油（1，2DAGs）在順序活化酸性鞘磷脂酶（acidic smase，SM）和蛋白激酶C（PKC）。這兩種酶的作用途徑并不一致，酸性鞘磷脂酶水解鞘磷脂產(chǎn)生神經(jīng)酰胺（ceramide），神經(jīng)酰胺可快速誘導(dǎo)NF-κB活化，通過一種尚未完全明確的途徑，而蛋白激酶C活化NF-κB則通過其他途徑。把NF-κB的調(diào)控信號(hào)分子（如TRAF2、ceramide）如何功能性地與TNF受體相關(guān)蛋白聯(lián)系在一起是一個(gè)仍待研究的問題。

3 抑制NF-κB能使細(xì)胞對(duì)TNF更為敏感

對(duì)NF-κB的認(rèn)識(shí)最初只限于細(xì)胞死亡相關(guān)等[10]。在應(yīng)激、免疫和炎癥刺激方面的作用也逐漸認(rèn)識(shí)。小鼠缺乏NF-κB以后，觀察到其肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡等退行性變，猜測(cè)這種現(xiàn)象可能與NF-κB有關(guān)，具體作用可能與胚胎細(xì)胞的凋亡能被NF-κB抑制相關(guān)，進(jìn)而推論出NF-κB也可以降低腫瘤細(xì)胞的凋亡。許多腫瘤細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)量非常高，細(xì)胞因子也有高量的表現(xiàn)，同時(shí)還表現(xiàn)出能抵抗TNF、射線、化療等介導(dǎo)凋亡的作用。NF-κB含量的增加、細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力之間存在著一定的密切關(guān)系，提示它們之間有一種內(nèi)在的恒定聯(lián)系。

給裸鼠移植大腸腺癌后再將NF-κB decoy腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB decoy雖然沒有影響腫瘤生長(zhǎng)，卻可抑制腫瘤引發(fā)的惡病質(zhì)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)降低，這些因子與腫瘤惡病質(zhì)效果是有關(guān)的。通過腺病毒載體將IκBα基因轉(zhuǎn)染Jurkat、MEF細(xì)胞株，然后再用TNF-α處理，與對(duì)照組（單用TNF-α處理）作比較，凋亡率結(jié)果為MEF細(xì)胞株67%與8%，Jurkat細(xì)胞株44%與4%[9]。在前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC3中，一組用TNF-α蛋白處理，另一組分別用NF-κB decoy和PDTC（pyrrolidine dithiocarbamate）聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，而單用TNF-α 50 ng/ml者，細(xì)胞生長(zhǎng)正常，而NF-κB decoy聯(lián)合TNF-α處理組中，細(xì)胞凋亡明顯增加，TNF-α用量可減至20 ng/ml?？梢娐?lián)合應(yīng)用NF-κB可以降低TNFα試用劑量并提高作用效果，而單純抑制NF-κB卻不能將腫瘤細(xì)胞直接殺傷[14]。在人前列腺癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型上，聯(lián)合應(yīng)用全硫代修飾的NF-κB抑制劑-雙鏈κB序列（AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC）與TNF-α基因進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，結(jié)果比較與單用TNF-α基因治療的對(duì)照組有顯著性差異，前者抑瘤率近2倍于后者，單用NF-κB抑制劑結(jié)果同樣對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無影響?？梢娭苯诱T導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展并不是NF-κB的作用，但作為轉(zhuǎn)錄激活因子，NF-κB會(huì)對(duì)產(chǎn)生這些細(xì)胞因子從基因水平發(fā)揮作用。研究證明，PC-3和DU145等細(xì)胞系可以表達(dá)諸如GM-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8等多種不同的細(xì)胞粘附因子和細(xì)胞分子，這些因子在腫瘤細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)中起不同的重要維持作用。NF-κB被活化后，轉(zhuǎn)錄調(diào)控不同的細(xì)胞分子，從而產(chǎn)生不同的效應(yīng)，這些均被以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)。不過也有不同的聲音，在肺鱗狀細(xì)胞癌，應(yīng)用攜帶IκBα基因的腺病毒載體做轉(zhuǎn)染處理，結(jié)果腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)被深度抑制，在其他實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)部分腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)可以被單純轉(zhuǎn)染IκBα所抑制，但這一結(jié)果不能適用于所有情況，討論中認(rèn)為可能與某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而導(dǎo)致腫瘤存活有關(guān)，也可能與細(xì)胞類型的不同和實(shí)驗(yàn)因素影響體內(nèi)外環(huán)境不同相關(guān)[15]。

通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)癌基因，NF-κB能促進(jìn)腫瘤的存活，如bcl-2和ras的上調(diào)表達(dá)，并在介導(dǎo)細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)化中起到作用等等[11-12]。單獨(dú)使用NF-κB decoy或IκBα，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，或者在多大程度上抑制生長(zhǎng)，這些還需要做深層次的研究。但是，抑制NF-κB能使腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF更為敏感，這一點(diǎn)是很肯定的。TNF-α需要抑制蛋白的參與來促進(jìn)和誘導(dǎo)凋亡。某些腫瘤細(xì)胞對(duì)TNFα具有天然抗性，如能通過NF-κB的激活，上調(diào)一些相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，來編碼抑制凋亡的蛋白，來促進(jìn)TNF-α對(duì)caspase-8的激活，即可增敏腫瘤細(xì)胞的TNF的反應(yīng)。有幾個(gè)基因c-IAP1&2、TRAF1&2可在此發(fā)揮作用。TNFα通過破壞腫瘤微血管系統(tǒng)導(dǎo)致壞死和凋亡誘導(dǎo)這兩個(gè)方面因素來使腫瘤消減加速[16]。前者目前研究較少，但誘導(dǎo)凋亡的研究有很多。實(shí)驗(yàn)證明，IκBα聯(lián)合TNFα治療，可使85%的動(dòng)物體內(nèi)瘤體完全消減，代之以瘢痕，對(duì)照組這一數(shù)據(jù)僅為15%。

雖然聯(lián)合應(yīng)用NF-κB抑制劑可提高TNF抗腫瘤藥物的效果，目前將NF-κB實(shí)際應(yīng)用于臨床仍有幾個(gè)問題。一是NF-κB是一個(gè)廣泛存在的分子，對(duì)它的抑制可使非腫瘤組織受到非特異性負(fù)面作用[15]。人工合成的NF-κB活性抑制劑如NF-κB decoy等，多數(shù)會(huì)發(fā)生很大的副作用，這些往往是由于那些非特異性的活性引起的。有報(bào)道已發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生了凋亡是由于IκBα基因轉(zhuǎn)染引起的[17]。二是需要提高IκBα基因治療的轉(zhuǎn)化效率來達(dá)到更好的成功率，但目前并不存在轉(zhuǎn)化效率達(dá)到100 %的載體，因此，能夠篩選出一種轉(zhuǎn)化率高的載體變得很重要。現(xiàn)在大家正在探索的新的研究方向，一種就是找到天然存在的NF-κB 活性抑制劑，再一種方法就是共同聯(lián)合其他凋亡基因，這也可能會(huì)產(chǎn)生超出預(yù)期的好效果。有研究用FADD基因轉(zhuǎn)染也可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]，推想如果能將NF-κB抑制劑與FADD聯(lián)合應(yīng)用會(huì)有好效果。

這些在NF-κB研究領(lǐng)域取得的成果，為TNF抗腫瘤的應(yīng)用提供新的思路。預(yù)期未來NF-κB在提高TNF效應(yīng)，減少TNF用藥量、降低TNF的毒副作用方面會(huì)發(fā)揮其關(guān)鍵作用。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB的功能涉及到多種病理過程[19-21]。雖然某些信號(hào)通路研究和作用機(jī)制已取得大量數(shù)據(jù)，但是NF-κB家族與IκB家族成員眾多，靶細(xì)胞類型多種多樣，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多且繁雜，各種通路所需要的具體分子存在差異，NF-κB深層次的作用機(jī)制與原理還有待更多更深入的研究[22-25]。相信今后經(jīng)過研究人員的不懈努力，NF-κB與機(jī)體、細(xì)胞、蛋白、基因和分子之間的調(diào)節(jié)作用與相互機(jī)制會(huì)得到進(jìn)一步完善和提高，在TNF抗腫瘤的應(yīng)用中能夠越來越成熟。

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