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        聯(lián)用多重連接酶依賴探針擴增技術(shù)和基因測序技術(shù)檢測地中海貧血基因缺陷

        2013-02-01 15:07:43黃國珍葉國永吳朝暉唋長順
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2013年22期
        關(guān)鍵詞:探針貧血篩查

        黃國珍 張 莉 葉國永 吳朝暉 唋長順

        1.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,廣東深圳 518118;2.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心,廣東廣州 511440

        我國常見的遺傳性血液病有很多種,其中之一就是地中海貧血病。在我國,地中海貧血病的高發(fā)地區(qū)主要集中在廣東、廣西、海南和福建等省份。在世界范圍內(nèi)保守估計[1],有近2億人攜帶此病基因[2],它已被世界衛(wèi)生組織列為危害人類健康的6種常見病之一。如果夫婦雙方都攜帶地貧基因,按照基因重組定律,他們子女就會有25%的可能是重型地中海貧血,50%的可能是輕型地中海貧血,另有25%才屬于正常。按照現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)水平,尚無有效治療地貧的方法,只有通過遺傳篩查和產(chǎn)前診斷才能有效杜絕重癥地貧患兒的出生[3]。本文回顧性分析了地中海貧血病患者110例,目的是聯(lián)用MLPA技術(shù)和基因檢測技術(shù),對地中海貧血病患者進行基因診斷。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        2011年10月~2013年2月來深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院就診的地中海貧血病患者110例,其中男56例,女54例,年齡 21~56 周歲,平均(34±3.4)周歲。在110例地中海貧血病患者中,重型41例,輕型69例。

        1.2 方法

        1.2.1 基因測序 將目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction,PCR)擴增,具體為,PCR反應(yīng)體系為每管10μL,提純的人體 DNA 樣本 1 μL,上下游引物各1μL,1μL 10×loading buffer,1 μL的酶,剩余量用 ddH2O 補足。PCR 反應(yīng)程序為,92℃ 2 min,(92℃ 25 s,55℃ 15 s,72℃ 40 s)進行35個循環(huán),最后4℃保存。再將基因擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)束后觀察,拍照。

        1.2.2 MLPA檢測 根據(jù)MLPA試劑盒說明書步驟進行實驗。先進行PCR擴增,具體步驟為,PCR反應(yīng)體系為每管10 μL,提純的人體 DNA 樣本 1 μL,上下游引物各 1 μL,1 μL 10×loading buffer,1 μL 的酶, 剩余量用 ddH2O 補足。PCR反應(yīng)程序為,92℃ 2 min,(92℃ 25 s,55℃ 15 s,72℃ 40 s)進行35個循環(huán),最后4℃保存。再取擴增產(chǎn)物2 μL加上甲酰胺和Ladder,加熱5 min,最后放在冰上10 min。最后進行電泳,時間為2 h。電泳完后用相關(guān)軟件進行分析。

        2 結(jié)果

        2.1 基因檢測結(jié)果

        對110例基因進行檢測,α1型地中海貧血病21例,α2型地中海貧血病27例,β型地中海貧血病62例。在62例β型地中海貧血病患者中,21例(33.9%)合并α型地中海貧血病雙重雜合子,41例(66.1%)是41~42雜合基因型。

        2.2 MLPA檢測結(jié)果

        通過MLPA檢測檢測又發(fā)現(xiàn)16例(14.55%)α型地貧缺失型。因為通過普通的基因檢測結(jié)果所發(fā)現(xiàn)的地中海貧血病基因缺失型僅僅只能包括中國人的90%,再加上MLPA檢測,基本就能覆蓋全中國人。

        3 討論

        地中海貧血病屬于遺傳性疾病,主要由基因缺陷導(dǎo)致的,鑒于現(xiàn)有的醫(yī)療水平,徹底根治此病尚有難度。所有對于地中海貧血病的預(yù)防已經(jīng)受到外國的重視。所以許多發(fā)達國家例如希臘、撒丁尼亞島、意大利和塞普路斯等從20世紀70年代起采取對地中海貧血病的預(yù)防措施,如普及地中海貧血病的病例知識,加強實施衛(wèi)生教育、加大對地中海貧血病篩查力度等方法,很好地控制了地中海貧血病在這些國家的發(fā)病率。甚至在有些國家地中海貧血病發(fā)病率降低到了0%,比如在意大利,年輕夫婦從臨床醫(yī)生和衛(wèi)生部門學(xué)習(xí)到關(guān)于遺傳風(fēng)險的知識,從而能更好地選擇生育時機,降低了地中海貧血病的發(fā)病率。亞太地區(qū)如新加坡等也是地中海貧血病的重災(zāi)區(qū),這些國家學(xué)習(xí)歐洲先進的預(yù)防方法和干預(yù)手段,也大大降低了地中海貧血病的發(fā)病率,已經(jīng)接近了0%。在中國,地中海貧血病高發(fā)地區(qū)是廣州,衛(wèi)生部門已對此有了高度的重視,也制定了相關(guān)的預(yù)防措施,力圖最大程度地降低地中海貧血病的發(fā)病率。

        預(yù)防地中海貧血病的關(guān)鍵就是能否有效地檢測和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者[4]。一旦準(zhǔn)確地檢測和篩查出地中海貧血病缺陷基因的攜帶者,就能指導(dǎo)他們進行合理的婚配和生育,就能預(yù)防地中海貧血病基因缺陷的胎兒出生,所以提高地中海貧血病缺陷基因的檢測和篩查水平有重要的意義。

        血紅蛋白電泳與血液學(xué)篩查是診斷地中海貧血的常用方法[5]。如用這兩種方法發(fā)現(xiàn)地中海貧血的疑似病例,就再通過基因檢測的方法確定是否為地中海貧血病基因缺陷。這一些系列的方法準(zhǔn)確度比較高,能發(fā)現(xiàn)中國人中90%的地中海貧血病基因缺失型。PCR法和反向斑點雜交技術(shù)是基因檢測中常用的兩種方法[6]。國際上檢測α型地中海貧血基因缺失的方法主要是單管多重PCR法,方法就是在一個PCR反應(yīng)體系里加入多對反應(yīng)引物,大概有3~4對,這樣能同時檢測多對等位基因,一般能同時檢測出3種地中海貧血病基因缺失,但對非缺失型基因,漏檢率較高。反響雜交發(fā)能檢測β型地中海貧血病的基因突變。這種方法能在同一張膜上同時檢測17~18對等位基因的突變,大大提高了工作效率,但漏檢率也不低,所以用PCR法和反向斑點雜交技術(shù)等基因檢測的方法還存在一定的漏洞,檢測率還不能達到100%。

        據(jù)文獻報道,一種全新的檢測技術(shù)已問世,它就是多重連接酶依賴探針擴增法,它能在一個Eppendorf管里準(zhǔn)確地檢測40多個基因序列[7]。現(xiàn)在已經(jīng)將此種方法引入到地中海貧血基因檢測領(lǐng)域[8],發(fā)現(xiàn)它能快速準(zhǔn)確地檢測出β地中海貧血的基因缺失和α地中海貧血缺失型。

        多重連接酶依賴探針擴增法的原理是這樣的,先設(shè)計出多對與目的序列互補的探針,它們一般能有效覆蓋真?zhèn)€目的序列[9]。再進行PCR擴增,得到40多種不同的DNA序列。最后進行電泳分析,檢測出缺陷基因。它的強大之處在于能同時檢測出所有的缺陷基因。對于檢測地中海貧血缺陷基因,多重連接酶依賴探針擴增法能同時檢測出α基因缺陷型和β缺陷型的基因[10],而且運用這種方法能檢測到人類所有的β珠蛋白基因(HBB)和正常的血紅蛋白基因(HbA)突變,很好地彌補了血紅蛋白電泳、血液學(xué)篩查和PCR法[11]、反向斑點雜交技術(shù)這幾種方法的技術(shù)缺陷[12]。

        通過本文的研究,發(fā)現(xiàn)運用基因測序技術(shù)能檢測到大部分的地中海貧血病,再聯(lián)用多重連接酶依賴探針擴增技術(shù)能更準(zhǔn)確的檢測到全部地中海貧血病,所以聯(lián)用多重連接酶依賴探針擴增技術(shù)和基因測序技術(shù)是檢測地中海貧血病有效的方法,為以后的臨床檢測提供了依據(jù)。

        [1]陳愛鳳.缺鐵性貧血和地中海貧血在血常規(guī)中的鑒別診斷[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(27):35-36.

        [2]葉國永,張莉,黃國珍,等.MLPA與基因測序技術(shù)檢測聯(lián)用檢測地中海貧血基因缺陷分析[J].醫(yī)學(xué)檢驗,2012,19(24):90-91.

        [3]肖維威,徐湘民,劉忠英.東南亞缺失型α地中海貧血的聚合酶鏈反應(yīng)快速診斷技術(shù)及產(chǎn)前診斷[J].中華血液學(xué)雜志,2000,21(4):192-194.

        [4]宋春林,范菊花,陳淑芬,等.基因測序在β地中海貧血稀有突變患者產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(7):15-17.

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