呂高虹 許惠琴 秦佩佩 劉 斌 劉 凱 (南京中醫(yī)藥大學教學實驗中心，江蘇 南京 210046)

高糖對人腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)的影響

呂高虹 許惠琴 秦佩佩 劉 斌 劉 凱 (南京中醫(yī)藥大學教學實驗中心，江蘇 南京 210046)

目的觀察不同濃度的葡萄糖對人腎小球系膜細胞增殖的影響及對細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fn)，Ⅳ型膠原(ColⅣ)的影響。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞株，分別加入葡萄糖終濃度為5.5、10、20、30、40 mmol/L進行處理，于不同時間段(12、24、48、72 h)用MTT法檢測腎小球系膜細胞的增殖情況，ELISA法檢測培養(yǎng)48 h后條件培養(yǎng)基中Fn及ColⅣ的含量。結(jié)果高糖作用12、24、48、72 h均能促進細胞的增殖，且隨著葡萄糖濃度升高作用時間的延長促進作用增強。檢測細胞上清液的Fn和ColⅣ。與對照組相比，30 mmol/L D-葡萄糖作用48 h后，F(xiàn)n和ColⅣ表達增高。結(jié)論高濃度葡萄糖對系膜細胞增殖作用具有量效及時效關系，我們選擇30 mmol/L濃度的葡萄糖作用48 h為最合適的細胞刺激條件。高濃度葡萄糖可促進系膜細胞細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，而系膜細胞細胞外基質(zhì)過度表達，可以直接導致細胞外基質(zhì)的積聚，從而導致腎小球硬化的發(fā)生，

人腎小球系膜細胞;細胞增殖;纖維連接蛋白;Ⅳ型膠原

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見而又最難治的微血管并發(fā)癥，其基本病理改變?yōu)榧毎饣|(zhì)(ECM)積聚和基底膜的增厚〔1〕。腎小球系膜細胞病變是DN最突出的病理改變之一，它是糖尿病腎病(DN)致病因子作用的主要靶細胞。高糖能刺激系膜細胞合成大量的系膜基質(zhì)，導致腎小球硬化，本研究旨在通過利用不同的葡萄糖濃度培養(yǎng)人腎小球系膜細胞株，探討不同濃度葡萄糖對人腎小球系膜細胞增殖及對細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fn)，Ⅳ型膠原(ColⅣ)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球系膜細胞 (HRMCs)，購自Sciencell，保持了正常人腎小球系膜細胞基本形態(tài)和生物學特性。D-葡萄糖購自Sigma公司，胰蛋白酶-EDTA消化液購自南京凱基生物技術有限公司，二甲基亞砜 (DMSO)購自南京化學試劑有限公司，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品，人纖維連接蛋白Fn、ColⅣELISA試劑盒，購自晶美生物公司，MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本三洋公司生產(chǎn)，倒置顯微鏡為日本Nikon Ti公司產(chǎn)品，全波長多功能酶標儀由BioTek公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法 人腎小球系膜細胞(HRMCs)置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液配制成單個細胞懸液，調(diào)整細胞密度為104～105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。細胞貼壁后，血清饑餓24 h，使同步化。在 96孔板中加入終濃度分別為 5.5，10，20，30，40 mmol/L葡萄糖，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，取出后每孔加入5 mg/m l的 MTT 溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，并每孔加入150μl DMSO終止反應，微型振蕩器震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，立即在酶標儀上波長570 nm處進行光密度定量檢測，以測得的光密度值(OD)反映細胞活性和數(shù)量的多少，收集細胞上清，檢測細胞上清中Fn及ColⅣ濃度，檢測方法參照Fn及ColⅣ試劑盒說明書進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 高糖對HRMCs的影響 MTT測定結(jié)果顯示 10、20、30、40 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)的HRMCs，隨濃度增加吸收度值增加，表明高濃度葡萄糖能促進人腎系膜細胞的增殖，且培養(yǎng)時間越長，促進作用越強，但在72 h作用下，細胞形態(tài)發(fā)生變化，因此綜合考慮，在48 h、30 mmol/L濃度下刺激作用最強。同劑量甘露醇沒有影響。結(jié)果見表1、表2。

2.2 高糖對HRMCs Fn、ColⅣ的影響 選擇D-葡萄糖刺激系膜細胞ECM產(chǎn)生的最佳反應時間點(48 h)觀察高糖條件下對細胞上清液Fn、ColⅣ的影響。實驗結(jié)果顯示高濃度葡萄糖能刺激Fn、ColⅣ的生成，與對照組比較有顯著性差異。見表3。

表1 不同濃度葡萄糖體外培養(yǎng)不同時間對HMCs增殖的影響(±s，n=5)

表1 不同濃度葡萄糖體外培養(yǎng)不同時間對HMCs增殖的影響(±s，n=5)

與5.5 mmol/L組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

葡萄糖濃度(mmol/L)12 h 24 h 48 h 72 h 5.5 0.264±0.012 0.352±0.025 0.523±0.01 0.857±0.018 10 0.263±0.004 0.352±0.03 0.53±0.038 0.884±0.0281)20 0.265±0.002 0.368±0.017 0.582±0.0252)0.937±0.0522)30 0.265±0.005 0.375±0.0151)0.607±0.0142)1.007±0.0962)40 0.264±0.008 0.359±0.02 0.541±0.01 0.899±0.0261)

表2 不同濃度甘露醇體外培養(yǎng)不同時間對HRMCs增殖的影響(±s，n=5)

表2 不同濃度甘露醇體外培養(yǎng)不同時間對HRMCs增殖的影響(±s，n=5)

甘露醇濃度(mmol/L)12 h 24 h 48 h 72 h 5.5 0.263±0.01 0.351±0.014 0.527±0.02 0.821±0.04 10 0.263±0.003 0.35±0.009 0.523±0.013 0.829±0.041 20 0.263±0.005 0.35±0.014 0.508±0.024 0.795±0.043 30 0.262±0.008 0.348±0.021 0.508±0.022 0.773±0.019 40 0.266±0.007 0.345±0.013 0.503±0.017 0.755±0.0332)

表3 高糖對HRMCs中Fn和ColⅣ表達的影響(±s，n=5)

表3 高糖對HRMCs中Fn和ColⅣ表達的影響(±s，n=5)

與5.5 mmol/L組比較:1)P＜0.05

指標5.5 10 20 30 Fn 2.447±0.502 3.267±0.362 3.823±0.3311)4.063±0.5061)ColⅣ 11.667±0.340 12.5±0.408 12.833±0.3301)13.8±0.8641)

3 討論

DN的主要病理特點包括腎小球毛細血管基底膜增厚、系膜外基質(zhì)增多、系膜區(qū)擴張及進一步發(fā)展形成的彌漫性腎小球硬化與結(jié)節(jié)性腎小球硬化，其中心環(huán)節(jié)是ECM的積聚。高糖是DN發(fā)病最重要的環(huán)境因素。在正常情況下，體外培養(yǎng)的HRMCs增殖能力和分泌ECM的能力很弱，在一定刺激因素的作用下HRMCs的生物學行為發(fā)生改變〔2〕。在高糖環(huán)境中，尤其是細胞內(nèi)的高糖可促進腎小球系膜細胞肥大，并使腎臟多種ECM成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原、Fn、LN及蛋白多糖合成增加〔3〕。有研究表明，10 mmol/L以上的高濃度葡萄糖可以促進HRMCs的增殖和膠原生成〔4，5〕。

ECM產(chǎn)生是糖尿病腎病發(fā)生的關鍵〔6〕，ECM是腎小球系膜區(qū)圍繞系膜細胞的非彌散的固相介質(zhì)，調(diào)節(jié)系膜細胞增生和分泌各種活性物質(zhì)，其中Fn和ColⅣ是構(gòu)成ECM的重要成分。Fn是一種分布廣泛的ECM糖蛋白，具有介導細胞黏附和創(chuàng)傷修復等多種功能，其在ECM中表達量的增多也是纖維化的重要促進因素之一。研究證實，F(xiàn)n是ECM中變化早而明顯的指標之一，作為一種始動因素，可以誘導ColⅣ的形成，促進腎小球硬化和腎纖維化。ColⅣ是構(gòu)成腎小球基底膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要膠原成分，正常情況下含量極微，其合成增多及降解減少致ECM積聚，是許多腎臟疾病發(fā)生、終至腎小球硬化的主要原因或重要參與因素之一。ColⅣ和Fn是能較敏感的反應基底膜膠原代謝的指標。

本實驗結(jié)果提示在一定劑量范圍內(nèi)，葡萄糖可促進細胞的增殖，甘露醇組細胞未見明顯變化，研究中，觀察到高糖環(huán)境中HRMCs產(chǎn)生 Fn，ColⅣ的含量明顯增加，這與 Nahman 等〔7〕的研究結(jié)果一致，他們同時證實了高糖可增加Fn的mRNA水平，高糖環(huán)境刺激體外培養(yǎng)HRMCs合成Fn增加的機制何在?研究表面，某些細胞因子可上調(diào)Fn的基因，這些因子包括γ-干擾素，血小板衍化生長因子，白介素-6，TGF-β等，在高糖環(huán)境中PKC的激活對HRMCs中Fn的積聚起重要作用〔8〕。系膜細胞ECM過度表達，可以直接導致ECM的積聚，從而導致腎小球硬化的發(fā)生，這與其他研究者報道一致〔9〕。進一步證實了高糖致腎小球硬化作用的分子基礎，這為我們尋找有效的方法在早期即阻斷這一作用提供了思路。

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3 尹永紅，呂 申.低分子肝素對腎小球系膜細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的影響〔J〕.大連醫(yī)科大學學報，2010;32(2):166-9.

4 鄧 紅，李海浪.高糖環(huán)境下腎小球細胞間相互作用對TGF-β1表達的影響及茶多酚的干預作用〔J〕.東南大學學報，2004;23(6):362-6.

5 張 艷，關廣聚，陳 兵，等.酶酚酸酯對高糖所致大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響〔J〕.山東大學學報(醫(yī)學版)，2006;44(7):718.

6 Rossert J，Terraz-Durasnel C，Bridean G.Growth factors，cytokines，and renal fibrosis during the course of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Metab，2000;26(4):16-24.

7 Nahman NS，Loohar T，Cosio FG，etal.Effects of high glucose on cellular proliferation and fibronectin by cultured human mesangial cells〔J〕.Kidney Int，1992;41:396.

8 邱紅渝，屈燧林.高糖濃度對人腎小球系膜細胞的作用〔J〕.重慶醫(yī)學，1999;11(28):412-3.

9 Liu W，Liu P，Tao S，et al.Berberine inhibits aldose reductase and oxidative stress in ratmesangial cells cultured under high glucose〔J〕.Arch Biochem Biophys，2008;475(2):128-34.

Effects of high glucose on proliferation of human mesangial cells and extracellular matrix

Lü Gao-Hong，XU Hui-Qin，QIN Pei-Pei，et al.
Research Center of Nanjing University of Traditional Chinese M edicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China

ObjectiveTo observe the effects of glucosewith different concentrations on humanmesangial cells(HRMCs)fibroneetin(Fn)and type collagenⅣ (ColⅣ).MethodsIn vitro HRMCswere put into different glucose concentrations respectively(5.5，10，20，30 and 40mmol/L)and processed in order to detect the proliferation of HRMCswith MTTmethod atdifferent times(12，24，48，72 h)and the contents of Fn and ColⅣ with ELISAmethod in 48 hours.ResultsHigh glucose could promote cell proliferation after12，24，48，72 h，and it became stronger as glucose concentration increasing and the time lasting longer.Compared with the control group，30 mmol/L D-glucose after 24 h，the expression of Fn and ColⅣ were increased.ConclusionsHigh glucose has a dose and time effecton the proliferation of HRMCs，glucose with 30 mmol/L and 48 h is the most appropriate conditions for cellular stimulation.High glucose can promote HRMCs to produce ECM，mesangial cell ECM over expression can directly lead to the accumulation of ECM，and the occurrence of glomerular sclerosis.

Human mesangial cells;Cell proliferation;Fibroneetin;Collagen Ⅳ

R39

A

1005-9202(2013)05-1066-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.037

國家自然科學基金資助項目(81073111)

許惠琴(1961-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事內(nèi)分泌藥理研究。

呂高虹(1976-)，女，實驗師，碩士在讀，主要從事內(nèi)分泌藥理研究。

〔2012-03-16收稿 2012-09-16修回〕

(編輯 曹夢園)