何金婷 莽 靖 胥桂華 楊 樂 王姣琦 包曉群 徐忠信

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長春 130033)

HSP70蛋白在神經(jīng)元樣PC12細胞氧糖剝奪后的表達變化

何金婷 莽 靖 胥桂華 楊 樂1王姣琦 包曉群 徐忠信

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長春 130033)

目的探討神經(jīng)細胞氧糖剝奪(OGD)造模后PC12細胞凋亡和熱休克蛋白(HSP)70水平，評價OGD模型。方法利用PC12細胞，經(jīng)NGF刺激誘導(dǎo)向神經(jīng)細胞分化，利用OGD建立神經(jīng)細胞OGD模型;利用MTT法、共聚焦顯微鏡鑒定PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞及OGD模型的建立，Western印跡檢測OGD后HSP70蛋白的表達。結(jié)果應(yīng)用終濃度50 ng/ml NGF的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞，隨培養(yǎng)時間的增加細胞呈典型的神經(jīng)元形態(tài)。微管相關(guān)蛋白(MAP)2免疫熒光細胞化學染色呈強陽性;建立OGD后神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的損傷、壞死及凋亡，隨OGD時間延長存活率逐漸降低、凋亡率升高、HSP70蛋白表達增加。結(jié)論NGF有效地誘導(dǎo)PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞，OGD可以有效誘導(dǎo)HSP70表達。

PC12細胞;氧糖剝奪;HSP70蛋白

缺血性腦損傷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制一直受到廣泛關(guān)注〔1〕，在缺血性腦損傷研究中需建立可模擬腦缺血損傷的體外細胞模型。本實驗采用神經(jīng)細胞株P(guān)C12細胞以神經(jīng)細胞生長因子(NGF)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細胞，進行氧糖剝奪(OGD)建立穩(wěn)定神經(jīng)細胞缺血缺氧模型，為進一步研究缺血性腦損傷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞株購自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基:美國Gibco公司生產(chǎn)。胎牛血清:北京鼎國公司生產(chǎn)。胰蛋白酶、噻唑藍、二甲基亞砜(DMSO)、鼠 NGF均為美國 Sigma生產(chǎn)?？篃嵝菘说鞍?0(HSP70)抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 Model550酶聯(lián)分析儀:美國BIO-RAD。醫(yī)用凈化工作臺;蘇州凈化設(shè)備公司。激光共聚焦顯微鏡:日本OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng)和微管相關(guān)蛋白2(MAP2)染色共聚焦顯微鏡觀察 PC12細胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100 U/ml青霉素、100 U/m l鏈霉素)中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)至細胞匯集80%，應(yīng)用含NGF培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d，觀察細胞生長情況。從24孔板中取出細胞爬片，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100通透10 min，預(yù)冷PBS洗滌3次，10%羊血清封閉30 min，吸取上清;加入一抗兔抗鼠MAP2 200μl(1∶500)，4℃過夜，預(yù)冷 PBS洗滌 3次，5 min/次;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔IgG二抗，使用防淬滅封片劑封片;使用激光共聚焦顯微鏡采集〔2〕。

1.2.2 PC12細胞OGD模型的建立 將直徑300 mm的真空干燥的玻璃塞塞入雙管橡皮塞，作為進出氣口。內(nèi)側(cè)端的乳膠管為出氣管(缸底液平以上)，另一根玻璃管外側(cè)端為進氣管(氣相連)。在缺氧罐內(nèi)注入約50 m l的無菌雙蒸水、40 g連二亞硫酸鈉，缺氧罐進氣管與氣瓶相連，打開氣瓶閥門，氣體流量為300 ml/min，當氣體充滿罐體后關(guān)閉進氣管和出氣管〔3〕。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將PC12細胞接種于六孔板中，NGF(100 ng/m l)刺激6 d 后分別進行 OGD 3、6、9、12、16、24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS洗滌3次，195μl結(jié)合液懸浮細胞，加入5μl FITC標記的Annexin V，室溫避光染色30 min;PBS洗滌1次，用200μl 1倍緩沖液重懸細胞，加入5μl碘化丙啶(PI)，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測及數(shù)據(jù)分析〔4〕。

1.2.4 Western印跡檢測HSP70蛋白表達 將PC12細胞NGF(100 ng/m l)刺激 6 d 后進行 OGD 3、6、9、12、16、24 h，收集細胞并計數(shù)，加入預(yù)冷細胞裂解液重懸PC12細胞，冰上30 min使細胞完全裂解。收集裂解液，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。煮沸，離心，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(恒壓100 V，3 h)，電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。使用5%脫脂牛奶按比例適當稀釋一抗，然后一抗孵育過夜。Fris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌膜，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色液曝光〔4〕。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件進行分析，最小顯著性差異法和方差分析進行各組數(shù)據(jù)均值之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 NGF誘導(dǎo)PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞的培養(yǎng) 隨培養(yǎng)時間增加，細胞突觸增粗增長，數(shù)量無明顯增加。培養(yǎng)1 d，細胞長出較短、較細的突觸;培養(yǎng)2 d，突觸數(shù)量及長度增加;培養(yǎng)3～6 d，突觸長度可達胞體的4～5倍，交織成網(wǎng)狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)。

2.2 共聚焦顯微鏡下觀察MAP2蛋白的表達 100 ng/ml NGF誘導(dǎo)PC12細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞培養(yǎng)6 d，MAP2免疫熒光染色結(jié)果顯示，可見呈散在分布、星形并帶有較長突起的綠色熒光區(qū)域，與背景對比明顯。

2.3 OGD誘導(dǎo)細胞凋亡檢測 對照組LR象限的細胞比例為0.25%，OGD 3、6、9、12、16、24 h LR 象限的細胞比例分別為2.34% 、3.68% 、5.12% 、11.64% 、18.44% 、23.72% 。OGD 12 h后LR象限細胞明顯增多，隨著OGD時間的增加，細胞凋亡數(shù)明顯增加，具有OGD時間依賴性。

2.4 OGD上調(diào)HSP70蛋白的表達 隨著OGD時間的增加，HSP70表達逐漸增加，與對照組(0.10±0.01)相比，OGD處理后1、2、3、4、5、6 d HSP70 的表達量明顯增加，分別為 0.16 ±0.03、0.32 ± 0.02、0.36 ± 0.03、0.55 ± 0.05、0.72 ± 0.11、0.78±0.18?？梢?，HSP70蛋白表達具有OGD時間依賴性，OGD可以有效誘導(dǎo)HSP70表達。見圖1。

圖1 不同時間OGD處理后HSP70蛋白的表達變化

3 討論

PC12細胞是鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤單克隆細胞株，可以在NGF作用下長出長突起，轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元樣細胞。本研究利用PC12細胞為實驗細胞株，NGF刺激后長出突觸，具有典型的神經(jīng)元形態(tài)。MAP2是特定的微管相關(guān)蛋白，與神經(jīng)細胞突觸長度和微管的形成密切相關(guān)，在神經(jīng)元突觸的生長中起重要作用〔5〕。本結(jié)果顯示，PC12細胞經(jīng)NGF誘導(dǎo)后，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察突觸的形成，結(jié)果表明NGF可以誘導(dǎo)PC12細胞產(chǎn)生MAP2，使PC12細胞產(chǎn)生突觸，向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)化。

神經(jīng)細胞的OGD多被用于在細胞水平模擬臨床腦卒中過程。本研究以PC12細胞為實驗細胞株，通過細胞持續(xù)性O(shè)GD建立OGD模型，模擬腦卒中的永久性局部腦細胞壞死過程，為進一步實驗奠定基礎(chǔ)。本研究在建立PC12細胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，利用持續(xù)性O(shè)GD建立OGD模型，應(yīng)用MTT法檢測細胞活力，結(jié)果顯示伴隨OGD時間的延長，細胞存活率逐漸由99.7%下降至65.8%。同時應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，OGD 12 h之前，雖細胞早期凋亡率逐漸升高，但變化并不明顯;OGD 12 h之后，細胞凋亡率迅速升高至較高水平，OGD 24 h時達到高峰。12 h可能是神經(jīng)元細胞從能量代謝障礙向衰竭、壞死過渡的域值。這種現(xiàn)象可能有兩個原因:(1)這種變化規(guī)律反映了神經(jīng)元本身可能具有一定的抗缺血缺氧能力;另一方面，短時間的OGD，神經(jīng)元自身的病理生理改變過程可能存在某種內(nèi)源性的抗損傷機制。HSPs可分為HSP90、HSP70、小分子HSP及泛素4個家族。其中HSP70具有保護腦細胞、增強腦細胞對缺氧的耐受性、進一步抵抗致死損傷的作用。短暫非致死性腦缺血/缺氧尚未出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化前，HSP70已經(jīng)迅速而有效地表達。因此，國內(nèi)外實驗研究常檢測HSP用于衡量缺血缺氧損傷。本實驗結(jié)果顯示，隨著OGD時間的延長，HSP70表達量明顯增加，神經(jīng)元樣細胞在OGD時，通過HSP70蛋白有效表達，維護細胞的功能和生存。

1 Lee JY，Lee JW.Schmidt CE.Neuroactive conducting scaffolds:nerve growth factor conjugation on active ester-functionalized polypyrrole〔J〕.J R Soc Interface，2009;6(38):801-10.

2 Bhat KM，Maddodi N，Shashikant C，et al.Transcriptional regulation of human MAP2 gene in melanoma:role of neuronal bHLH factors and Notch1 signaling〔J〕.Nucleic Acids Res，2006;34(13):3819-32.

3 Larsena EC，Hatchera JF，Adibbatla RM.Effect of D609 of tricyclodecana-yl potassium xanthte(0609)on phospholipid metabolism and cell death during oxygen-glucose deprivation in PC12 cells〔J〕.Neuroscience，2007;46(3):946-61.

4 Genetos DC，Whitney K.Oxygen tension modulates neurite outgrowth in PC12 cells through a mechanism involving HIF and VEGF〔J〕.JMol Neurosci，2010;40:360-6.

5 Mnich K，F(xiàn)inn DP，Dowd E，et al.Inhibition by an andamide of 6-hydroxydopamine induced cell death in PC12 cells〔J〕.Int JCell Biol，2010;97:818497.

R74

A

1005-9202(2013)12-2806-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.033

吉林省自然基金資助項目(No.201015181);吉林省科技發(fā)展計劃國際合作資助項目(No.20120723);吉林省科技發(fā)展計劃青年基金資助在項目(No.20130522024JH，201201016)

1 吉林省人民醫(yī)院

包曉群(1965-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦缺血研究。

徐忠信(1965-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事缺血性腦損傷與保護研究。

何金婷(1980-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事腦缺血損傷研究。

〔2013-01-11收稿 2013-03-26修回〕

(編輯 袁左鳴)