陳 許 孫仁華 韓 芳 黃 瑾(浙江省人民醫(yī)院ICU，浙江 杭州 3004)

老年慢性阻塞性肺疾病患者淋巴細(xì)胞對肺炎鏈球菌莢膜多糖的反應(yīng)能力

陳 許 孫仁華 韓 芳 黃 瑾1(浙江省人民醫(yī)院ICU，浙江 杭州 310014)

目的分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年人體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞在肺炎鏈球菌莢膜多糖干預(yù)環(huán)境下活化情況。方法研究對象分為老年COPD，健康老年，健康年輕3組，分離外周單個(gè)核細(xì)胞以PPV23干預(yù)培養(yǎng)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD3+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá)。結(jié)果健康年輕組淋巴細(xì)胞對莢膜多糖抗原干預(yù)有顯著反應(yīng)，健康老年組T、B淋巴細(xì)胞及老年COPD組B淋巴細(xì)胞對多糖抗原干預(yù)無反應(yīng)，老年COPD組T淋巴細(xì)胞對多糖抗原反應(yīng)與健康年輕人組相反。結(jié)論CD69為標(biāo)志的各組人群T、B淋巴細(xì)胞對肺炎鏈球菌抗原刺激的反應(yīng)能力不同，COPD老年人及健康老年人進(jìn)行PPV23免疫后難以產(chǎn)生同健康年輕人相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?/p>

慢性阻塞性肺疾病;肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗;淋巴細(xì)胞;CD69

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是多發(fā)于老年人的慢性疾病，異常免疫反應(yīng)在其起病和進(jìn)展中的作用越來越引起重視，在細(xì)胞因子多態(tài)性、miRNA表達(dá)、DNA甲基化等方面都可以發(fā)現(xiàn)衰老的免疫系統(tǒng)促進(jìn)了COPD的發(fā)病〔1〕。CD69是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，在多種血細(xì)胞包括T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞表面都有表達(dá)，在諸多研究中被作為細(xì)胞表面活化標(biāo)志尤其是T、B淋巴細(xì)胞活化表面標(biāo)志〔2〕。肺炎鏈球菌是COPD患者呼吸道感染常見的病原菌，莢膜多糖是其毒力因子。23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV23)由23個(gè)血清型的肺炎鏈球菌莢膜多糖組成，在老年人及慢性疾病包括COPD患者中，PPV23的效力和推薦一直存在爭議〔3～6〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察體外培養(yǎng)條件下老年 COPD患者肺炎鏈球菌致病因素干預(yù)下的免疫細(xì)胞活化情況，來探討老年COPD免疫狀態(tài)是否適合接受肺炎鏈球菌多糖疫苗免疫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 我院住院部老年COPD急性發(fā)作期患者18例，男14例，女4例，74～81歲，平均(76.62±2.72)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病協(xié)會(huì)制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。健康老年組14例，男9例，女5例，60～80歲，平均(68.71±8.79)歲;健康年輕組22例，男13例，女9例，21～49歲，平均(29.36±7.84)歲，健康老年及年輕組為醫(yī)院體檢健康者。排除標(biāo)準(zhǔn):患有其他肺部疾病，嚴(yán)重的心功能不全，慢性肝、腎疾病，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，先天性或獲得性免疫缺陷，接受系統(tǒng)性免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制治療(包括口服糖皮質(zhì)激素)。曾經(jīng)注射過肺炎鏈球菌疫苗。近1個(gè)月內(nèi)有感染性疾病病史。

1.2 主要試劑及儀器 23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV23)購自美國默沙東公司;淋巴細(xì)胞分離液(1.073 g/ml)購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;鼠抗人CD3-PerCP、鼠抗人CD19-PE、鼠抗人 CD69-FITC、小鼠 IgG1-FITC/小鼠抗人 IgG1-PE購自美國Becton Dickinson公司;完全培養(yǎng)基(CM)包括RPMI-1640(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，HEPES(MD公司)，鏈毒素(100萬 U/支，華北制藥股份有限公司，青霉素(80萬U/支哈藥集團(tuán)制藥總廠)，L-谷氨酰胺(MBCHEM公司)。24孔培養(yǎng)板為美國Corning公司出產(chǎn);HERA Cell CO2培養(yǎng)箱為德國Heraeus公司出產(chǎn);FACSCalibur型流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司出產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 外周單個(gè)核細(xì)胞的體外干預(yù)培養(yǎng) 肝素抗凝管取外周靜脈血10 ml，D-Hank液稀釋1倍。將稀釋后靜脈血加入淋巴細(xì)胞分離液液面上，1 800 r/min離心15 min。吸出灰白色云霧層細(xì)胞，D-Hank液1 000 r/min離心10 min洗滌2次，以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106/ml。依照預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整的濃度，取PPV23 100倍稀釋，制成每1μl液體含疫苗0.01μl的稀釋溶液。設(shè)抗原干預(yù)組及空白對照組，設(shè)復(fù)孔進(jìn)行培養(yǎng)。含5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，取細(xì)胞懸液檢測。于抗原干預(yù)孔添加稀釋疫苗溶液10μl，空白對照孔添加生理鹽水10μl繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24及48 h后，檢測相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志。

1.3.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD3+細(xì)胞、CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá) ①陰性對照管中加入小鼠抗人IgG1-FITC、小鼠抗人IgG1-PE單抗各20μl，測定管中加入鼠抗人CD3-PerCP、鼠抗人CD19-PE、鼠抗人CD69-FITC單抗各20μl。②加入待測細(xì)胞懸液100μl/管，混勻，室溫避光孵育15min。③加入PBS2 ml，混勻，流式細(xì)胞儀CellQuest程序，檢測10 000個(gè)細(xì)胞。④陰性對照管做FSC-SSC散點(diǎn)圖，設(shè)門R1排除碎屑，再作IgG1-FITC/IgG1-PE散點(diǎn)圖，設(shè)陰性對照十字門使其包括左下象限95%細(xì)胞。⑤測定管數(shù)據(jù)做FSC-SSC散點(diǎn)圖，設(shè)門R2圈出淋巴細(xì)胞，再作CD3-PerCP/CD69-FITC散點(diǎn)圖、鼠抗人 CD19-PE/CD69-FITC散點(diǎn)圖，根據(jù)陰性對照統(tǒng)計(jì)CD3+CD69+細(xì)胞及CD19+CD69+細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)為陽性細(xì)胞百分率，以±s表示。兩組數(shù)據(jù)為正態(tài)分布及方差齊或者經(jīng)轉(zhuǎn)換后成為正態(tài)分布或者方差齊者，采用配對T檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)經(jīng)過轉(zhuǎn)換成為正態(tài)分布，轉(zhuǎn)換后采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用LSD方法。

2 結(jié)果

2.1 PBMC體外培養(yǎng)CD3+及CD69+細(xì)胞表面CD69表達(dá)率3組PBMC體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，在疫苗干預(yù)前對淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。與健康年輕組比較，健康老年組和老年COPD組CD3+及CD69+細(xì)胞表面CD69表達(dá)率明顯降低(P＜0.05，P ＜0.01)，見表1。

2.2 PBMC疫苗干預(yù)培養(yǎng)24 h后CD3+及CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá)率 PBMC在疫苗干預(yù)培養(yǎng)24 h后，健康年輕組CD3+細(xì)胞表面CD69的表達(dá)疫苗干預(yù)組高于對照組(P＜0.05)。健康老年組疫苗干預(yù)培養(yǎng)與對照相比CD3+細(xì)胞表面CD69表達(dá)無顯著差異。老年COPD組CD3+細(xì)胞表面CD69的表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.05)。CD19+細(xì)胞表面CD69的表達(dá)，健康年輕組疫苗干預(yù)組顯著高于對照組(P＜0.05)。PBMC多糖疫苗干預(yù)培養(yǎng)24 h后，健康老年組及老年COPD組疫苗干預(yù)培養(yǎng)與對照相比，CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 PBMC疫苗干預(yù)培養(yǎng)48 h后CD3+及CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá)率 PBMC多糖疫苗干預(yù)培養(yǎng)48 h后，CD3+細(xì)胞表面CD69表達(dá)健康年輕組干預(yù)后顯著高于對照組(P＜0.05)。健康老年組疫苗干預(yù)與對照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。老年COPD組疫苗干預(yù)顯著低于對照組(P＜0.01)。健康年輕組、健康老年組及老年COPD組疫苗干預(yù)與對照組相比，CD19+細(xì)胞表面CD69表達(dá)均無顯著差異。見表3。

表1 疫苗刺激前細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)率(±s，%)

表1 疫苗刺激前細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)率(±s，%)

與健康年輕組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

指標(biāo) 健康年輕組(n=22)健康老年組(n=14)老年COPD組(n=18)F值 P值8.441 0.002 CD19+CD69+ 0.80±0.46 0.39±0.252) 0.46±0.242)CD3+CD69+ 1.39±0.62 0.48±0.301) 0.65±0.461)3.596 0.045

表2 疫苗干預(yù)培養(yǎng)24 h CD3+CD69+、CD19+CD69+細(xì)胞比率(±s，%)

表2 疫苗干預(yù)培養(yǎng)24 h CD3+CD69+、CD19+CD69+細(xì)胞比率(±s，%)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 n CD3+CD69+對照組 干預(yù)組健康年輕組 22 0.59±0.31 0.64±0.361) 0.41±0.44 0.45±0.351)干預(yù)組CD19+CD69+對照組健康老年組 14 0.40±0.18 0.47±0.21 0.24±0.25 0.23±0.13老年COPD組18 0.64±0.41 0.55±0.361)0.23±0.27 0.30±0.34

表3 疫苗干預(yù)培養(yǎng)48 h CD3+CD69+、CD19+CD69+細(xì)胞比率(±s，%)

表3 疫苗干預(yù)培養(yǎng)48 h CD3+CD69+、CD19+CD69+細(xì)胞比率(±s，%)

與對照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01

組別 n CD3+CD69+對照組 干預(yù)組健康年輕組 22 0.44±0.21 0.65±0.481)干預(yù)組CD19+CD69+對照組0.21±0.16 0.27±0.24健康老年組 14 0.48±0.27 0.42±0.39 0.48±0.27 0.42±0.39老年COPD組18 0.42±0.36 0.39±0.312)0.42±0.36 0.39±0.31

3 討論

免疫衰老影響固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能，老年人免疫功能出現(xiàn)一系列年齡相關(guān)的變化，NK細(xì)胞殺傷力降低，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞數(shù)量和功能下降，同時(shí)初始T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，記憶性T、B淋巴細(xì)胞及效應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，增加感染性疾病的易感性和嚴(yán)重程度，同時(shí)也影響了老年人對疫苗的免疫反應(yīng)〔8〕。同健康成年人相比，老年人對疫苗的免疫反應(yīng)明顯降低〔9〕。Goodwin等〔9〕對1986 ～2002 年間31項(xiàng)關(guān)于疫苗抗體反應(yīng)的研究進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)老年人對流感疫苗的抗體反應(yīng)顯著低于年輕人，約70%～90%年輕人使用疫苗臨床有效，而僅有17%～53%的老年人可以達(dá)到相同的臨床效果。Rubins等〔10〕對老年人使用肺炎疫苗后抗體生成及活性的研究中，抽取大于65歲并合并穩(wěn)定慢性疾病老年人及小于35歲健康年輕人，使用PPV23免疫后1個(gè)月及3個(gè)月后，對抗體活性及調(diào)理作用進(jìn)行測定，大約20%老年人對某些血清型低反應(yīng)，而幾乎所有年輕人對疫苗都反應(yīng)良好。

本文發(fā)現(xiàn)老年COPD患者T、B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)活化程度低于年輕人，體現(xiàn)了老年人免疫細(xì)胞活性減低的狀態(tài)。免疫狀態(tài)處于正常的年輕人，PBMC在肺炎鏈球菌莢膜多糖刺激下體外培養(yǎng)24、48 h，多糖抗原干預(yù)組CD69+在CD3+細(xì)胞表面表達(dá)均超過對照組，符合CD69在T淋巴細(xì)胞活化早期表達(dá)的特征。CD69在CD19+細(xì)胞表面表達(dá)在24 h高于對照組，48 h同對照組無顯著差異，證明免疫細(xì)胞功能處于正常狀態(tài)的年輕人，B淋巴細(xì)胞對多糖抗原共培養(yǎng)早期有反應(yīng)，而24 h之后則檢測不出。多糖抗原對CD69在健康老年人CD3+細(xì)胞及CD19+細(xì)胞表面的表達(dá)均未發(fā)現(xiàn)有影響，干預(yù)組和對照組相比CD3+CD69+細(xì)胞及CD19+CD69+細(xì)胞比率亦無顯著差別。隨著年齡增長，免疫細(xì)胞對疫苗抗原的反應(yīng)消失，免疫細(xì)胞對該疫苗抗原的作用處于惰性狀態(tài)，這與一部分老年人對疫苗處于無應(yīng)答狀態(tài)相符合。本文表明COPD老年人T淋巴細(xì)胞的活化程度在早期24 h受到了多糖抗原的影響，但是與多糖抗原對健康年輕人也就是免疫力正常人的影響方向是相反的，并且未患COPD的老年人T淋巴細(xì)胞在24 h無此種變化。因此，不排除PPV23可能會(huì)引起COPD老年人T淋巴細(xì)胞非正常的免疫反應(yīng)。COPD老年人CD69在CD19+細(xì)胞表面表達(dá)同健康老年人一樣，并未發(fā)現(xiàn)疫苗抗原對B細(xì)胞活化有影響。可見在相同的體外培養(yǎng)條件下，COPD老年人、健康老年人同健康年輕人相比，以CD69表達(dá)為標(biāo)志疫苗抗原引起的T、B淋巴細(xì)胞活化反應(yīng)是不同的，老年人T、B淋巴細(xì)胞對多糖抗原的刺激的反應(yīng)處于非活躍狀態(tài)，由于COPD的影響，T淋巴細(xì)胞甚至可能會(huì)出現(xiàn)同免疫力正常的年輕人相悖的反應(yīng)。

疫苗保留了病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力，因此疫苗免疫效果與機(jī)體對疫苗抗原反應(yīng)是相關(guān)的。綜上所述，COPD老年人及健康老年人接種PPV23疫苗后，難以產(chǎn)生與健康年輕人相同的免疫反應(yīng)，對該兩類人群進(jìn)行PPV23免疫后可以產(chǎn)生等同于健康年輕人相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч硎緫岩?，僅從體外培養(yǎng)T、B淋巴細(xì)胞對疫苗反應(yīng)的單方面來看，本研究結(jié)果不支持COPD老年人和健康老年人常規(guī)使用PPV23免疫。

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R392.7

A

1005-9202(2013)12-2767-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.015

1 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院

黃 瑾(1960-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病及哮喘免疫功能的研究。

陳 許(1984-)，女，博士，醫(yī)師，主要從事慢性阻塞性肺疾病及呼吸衰竭免疫功能的研究。

〔2012-10-22收稿 2013-03-19修回〕

(編輯 張 慧)