成 捷 岑錦明 楊希立 荊 霞 劉新光 熊興東 (廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所，廣東 東莞 5808)

miR－26a－1 rs7372209基因多態(tài)性與冠心病遺傳易感的關(guān)系

成 捷1岑錦明2楊希立2荊 霞3劉新光1熊興東1(廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所，廣東 東莞 523808)

目的研究miR-26a-1 rs7372209基因型和等位基因頻率分布，探討miR-26a-1 rs7372209基因多態(tài)性與華南地區(qū)漢族人冠心病遺傳易感的關(guān)系。方法利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCR-LDR)分析技術(shù)，對295例冠心病患者和283名對照個體的miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分型，采用非條件邏輯回歸分析統(tǒng)計該多態(tài)位點(diǎn)與冠心病易感的相關(guān)性。結(jié)果CC、CT、TT基因型在冠心病組中的分布頻率分別為54.6%、37.6%和7.8%，在對照組中分別是57.2%、37.5%和5.3%，兩組間基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.554，P=0.460)。攜帶miR-26a-1 rs7372209 T變異等位基因與冠心病的遺傳易感無明顯相關(guān)(OR=1.15，95%CI=0.88～1.49，P=0.315)。結(jié)論miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)位點(diǎn)與華南地區(qū)漢族人冠心病易感無相關(guān)性。

miR-26a-1;單核苷酸多態(tài)性;冠心病;遺傳易感性

冠心病的危險因素除了常見的高血脂、高血壓、糖尿病和吸煙等外，人們逐漸認(rèn)識到遺傳背景對冠心病的發(fā)生與發(fā)展也起到重要的作用〔1〕。而單核苷酸多態(tài)性(SNP)是影響個體對疾病易感的重要遺傳因素。研究表明，miR-26a-1 rs7372209多態(tài)位點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和口腔黏膜癌前病變的遺 傳易感 密 切 相 關(guān)〔2～5〕。迄 今 為 止，有 關(guān) miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)與冠心病的遺傳易感性尚未見報道。為闡明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)對冠心病遺傳易感的影響，本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(PCRLDR)技術(shù)檢測miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)基因型在華南地區(qū)冠心病患者及對照人群中的發(fā)生頻率，探討miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)位點(diǎn)與冠心病遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 包括283例對照組人群和295例冠心病患者的病例組?；颊邩颖倦S機(jī)收集自2011年3月至2012年2月在佛山市第一人民醫(yī)院治療，并且經(jīng)冠狀動脈造影等檢查確診為冠心病的患者。冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國際心臟病學(xué)會及WHO臨床命名《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》，冠狀動脈造影時顯示主要動脈中至少有1支內(nèi)徑狹窄＞50%。對照組是經(jīng)心臟ECT(心臟核素掃描)、冠脈CTA(CT冠脈成像)或冠狀動脈造影等檢查排除冠心病的個體。所有冠心病患者和正常對照個體均為無血緣關(guān)系的華南地區(qū)漢族人群，排除先天性心臟病、心肌病、嚴(yán)重肝臟和腎臟疾病。每例標(biāo)本都具備年齡、性別、有無吸煙、有無喝酒、收縮壓和舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、冠心病家族史等資料。在標(biāo)本采集過程中，所有入選個體在入選時均告知其研究方法及其意義，做到知情同意。本研究得到了佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實驗耗材與設(shè)備 TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒(TianGen)，Taq DNA聚合酶和DL2000TMDNA Marker(Taka-ra)，Mastercycler?ep PCR 儀(Eppendorf)，ABI PRISM 377 DNA測序電泳儀(ABI)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA抽提 每份樣品均取靜脈血2 ml，EDTAK2抗凝，按照TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒說明抽提外周血基因組DNA。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因分型 采用PCR-LDR方法對miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)進(jìn)行基因分型。①rs7372209多態(tài)的引物和探針:引物和探針由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。引物序列:上游:5'TTTGCAAAAGCATCAACTGAA3'，下游:5'ATATCACAGCACAGCCAGGA3'。探針序列:rs7372209(C＞T)_FAM 探針:5'AAGGATTAATTTCTCTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3';rs7372209(C＞T)_C探針:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGGTACG3';rs7372209(C＞T)_T探針:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGG TACA3';② PCR 反應(yīng)體系20 μl，基因組 DNA 1 μl，dNTP 2 μl，引物各0.5μl，10×PCR緩沖液2μl，Taq DNA 聚合酶0.5μl;PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15 min，然后94℃變性30 s，59℃退火1 min 30 s，72℃延伸 1 min，共 35次循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察PCR產(chǎn)物的效果，擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為249 bp，確定其作為模板在LDR反應(yīng)中加入的量。③LDR反應(yīng)體系10μl，特異性探針1μl，PCR產(chǎn)物1μl，緩沖液1μl，連接酶0.05μl;LDR反應(yīng)程序:95℃ 2 min，然后94℃變性15 s，50℃反應(yīng)25 s，共30次循環(huán)。LDR片段長度分別為102 bp，104 bp。④產(chǎn)物經(jīng)ABI 377電泳測序，結(jié)果運(yùn)用GeneMapper 4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用goodness-of-fitχ2檢驗多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;冠心病組和對照組中連續(xù)性變量資料采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，分類變量資料采用χ2檢驗分析。Pearsonχ2檢驗比較冠心病患者與對照組的基因型分布差異;非條件邏輯回歸計算比值比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)，分析基因型與冠心病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。所用統(tǒng)計軟件為SPSS13.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組和對照組一般情況的比較 該研究入選對象的性別和HDL-C在冠心病組和對照組中無顯著差異。但收縮壓、舒張壓、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、LDL-C、冠心病家族史、飲酒、吸煙指數(shù)中冠心病組顯著高于對照組，提示高血壓、高血脂、吸煙、喝酒等是我國人群罹患冠心病的主要風(fēng)險因素(表1)。

2.2 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因型的分布及Hardy-Weinberg平衡檢驗 在所調(diào)查的人群中可檢出rs7372209的3種基因型為CC型、CT型、TT型。純合子的LDR探針擴(kuò)增測序圖譜為單峰，雜合子的測序圖譜為雙峰，見圖1。采用雙盲法隨機(jī)抽取10%正常對照和冠心病標(biāo)本進(jìn)行PCR-LDR重復(fù)驗證，結(jié)果顯示測序結(jié)果100%一致。miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)的基因型分布頻率在華南地區(qū)對照人群中分別為57.2%(CC)、37.5%(CT)和5.3%(TT)。Goodness-of-fitχ2檢驗表明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)位點(diǎn)在對照組中符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.663)，表明本研究人群具有群體代表性，該人群的miR-26a-1 rs7372209基因型分布可反映整體人群基因型的分布情況。

2.3 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)與冠心病遺傳易感的關(guān)系 CC、CT、TT基因型在冠心病組中的分布頻率分別為54.6%、37.6%和7.8%，在對照組中分別是57.2%、37.5%和5.3%，兩組間基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.554，P=0.460)。非條件邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)，以CC基因型作參照，CT基因型和TT基因型分別與其比較，均與冠心病易感無相關(guān)性(OR值分別為1.05和1.54，95%CI分別為0.75～1.49和0.78～3.06)。等位基因分析結(jié)果也顯示，攜帶 miR-26a-1 rs7372209 T變異等位基因與冠心病的遺傳易感無明顯相關(guān)(OR=1.5，95%CI=0.88 ～1.49，P=0.315)。此外，對年齡、性別、吸煙和冠心病史進(jìn)行分層分析，均未發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)果。

圖1 m iR-26a-1 rs7372209 C＞T多態(tài)LDR分型結(jié)果圖

表1 冠心病組和對照組人群的臨床特征分析(±s)

表1 冠心病組和對照組人群的臨床特征分析(±s)

臨床資料 對照組(n=283)冠心病組(n=295)P值62.59±12.89 65.13±11.86 0.014性別〔n(%)〕 男 170(60.1) 195(66.1) 0.133女 113(39.9) 100(33.9)吸煙〔n(%)〕 無 198(70.0) 111(37.6) ＜0.001有 85(30.0) 184(62.4)喝酒〔n(%)〕 無 264(93.3) 210(71.2) ＜0.001有 19(6.7) 85(28.8)收縮壓(mmHg) 137.25±14.90 144.96±15.53 ＜0.001舒張壓(mmHg) 73.99±8.35 78.79±8.28 ＜0.001 FPG(mmol/L) 5.82±1.05 6.65±1.23 ＜0.001 TG(mmol/L) 1.48±0.71 2.19±1.07 ＜0.001 TC(mmol/L) 4.59±1.14 4.87±1.21 0.002 LDL-C(mmol/L) 2.75±0.77 3.09±0.82 ＜0.001 HDL-C(mmol/L) 1.21±0.32 1.25±0.37 0.159冠心病家族史〔n(%)〕無 280(98.9) 235(79.7) ＜0.001有 3(1.1) 60(20.3)年齡(歲)

3 討論

越來越多的研究表明，包括SNPs在內(nèi)的遺傳因素在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而miRNAs在心臟發(fā)育，心肌肥厚，心律失常，血管生成，血管內(nèi)膜損傷及動脈粥樣硬化斑塊形成和不穩(wěn)定等過程中發(fā)揮重要的作用〔6，7〕。本文提示miRNAs的基因多態(tài)性可能與冠心病的遺傳易感性密切相關(guān)。

有研究表明，miR-26a-1 rs7372209多態(tài)位點(diǎn)在非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸癌，膀胱癌和口腔黏膜癌前病變的發(fā)生過程中發(fā)揮重要角色，例如，miR-26a-1 rs7372209多態(tài)位點(diǎn)可使女性膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險降低64%〔4〕，但使口腔黏膜癌前病變的發(fā)病風(fēng)險升高2倍〔5〕。研究提示miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)與華南地區(qū)冠心病的發(fā)生沒有相關(guān)性。此外，對年齡、性別、吸煙和冠心病史進(jìn)行分層分析，也均未發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)果，該結(jié)果進(jìn)一步說明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態(tài)與這些冠心病發(fā)生的重要因素?zé)o關(guān)，這也可能是它不影響個體患冠心病發(fā)病風(fēng)險的原因之一。冠心病是多因素疾病，不同遺傳背景和不同的環(huán)境危險因素對冠心病的發(fā)生有著重要的影響。因此，對于miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系，仍需要在不同人種、不同的民族和不同的環(huán)境危險因素的作用下，探討該多態(tài)位點(diǎn)對冠心病發(fā)病風(fēng)險的影響。

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Relationship between m iR-26a-1 rs7372209 polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease

CHENG Jie，CEN Jin-M ing，YANG Xi-Li，et al.
Institute of Aging Research，Guangdong M edical College，Dongguan 523808，Guangdong，China

ObjectiveTo investigate the distribution ofgenotypes and alleles ofmiR-26a-1 rs7372209 polymorphism，and the correlation between this polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease(CAD)in the Han nationality of Southern China.MethodsThe genotypes of themiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism were determined in 295 CAD patients and 283 control blood donors by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR).Association between the polymorphism and the risk for CAD was evaluated using unconditional logistic regression analysis.ResultsThe frequency of CC，CT and TT genotypes in the case subjects were 54.6%，37.6%and 7.8%respectively and in the control subjectswere57.2%，37.5%and 5.3%.No significantdifferencewas observed in the frequency ofmiR-26a-1 genotypes between cases and controls(χ2=1.554，P=0.460).Moreover，no significantly increased risk for CAD was observed for those carrying T variant allele(OR =1.15，95%CI=0.88 ～ 1.49，P=0.315).ConclusionsmiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism is not associated with CAD in the Han nationality of Southern China.

miR-26a-1;Single nucleotide polymorphism;Coronary artery disease;Genetic susceptibility

R349.3

A

1005-9202(2013)12-2737-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.001

國家自然科學(xué)基金(No.81000143，81170327);廣東省自然科學(xué)基金(No.S2011010002922);東莞市科技計劃醫(yī)療衛(wèi)生類重點(diǎn)項目(No.2011105102007);廣東省衛(wèi)生廳科研基金(No.A2011431，B2009191);廣東醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新基金(No.STIF201102)

1 廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

2 佛山市第一人民醫(yī)院 3 廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實驗室

熊興東(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事衰老及老年性疾病的分子機(jī)制研究。

成 捷(1988-)，女，在讀碩士，主要從事衰老及老年性疾病的分子機(jī)制研究。

〔2012-09-19收稿 2013-01-12修回〕

(編輯 曹夢園)