李彥，關(guān)麗麗，牟妍，孫磊麗，梁君妮，沙美蘭，鄒文曉，孫愛麗，曹鵬，*

（1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái)264000；2.青島科技大學(xué)，山東青島264200）

金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥[1-2]，因其在體內(nèi)降解代謝的量極微，主要以原形隨體液排出，若長期食用殘留量高或被此類藥物污染的食品，會(huì)在人體內(nèi)積累易致蓄積中毒，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響[3-4]。金剛烷胺是國家明令禁止向食品中添加的禁用物，日本也于2013年2月15日發(fā)布通知，在進(jìn)口食品監(jiān)控計(jì)劃中加入對(duì)中國產(chǎn)雞肉中金剛烷胺的檢查。但由于其藥理作用，國內(nèi)有部分商販將金剛烷胺用于雞、豬流感[5]的預(yù)防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。我國對(duì)于畜禽組織食品中金剛烷胺殘留含量未曾制定或立項(xiàng)過國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，國際上也無特定限量要求及相應(yīng)檢測方法。為了保障人民飲食安全，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法對(duì)食品中金剛烷胺殘留含量進(jìn)行檢測，同時(shí)其對(duì)于指導(dǎo)進(jìn)出口食品中金剛烷胺含量控制，消除潛在的出口貿(mào)易障礙，具有緊迫的現(xiàn)實(shí)意義。

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Rugged，Safe）[6]，是由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades 教授等于2003年開發(fā)的，近年來國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)[7-10]。由于該方法穩(wěn)定可靠、分析速度快，本文采用1%乙酸乙腈萃取、QuEChERS 法凈化、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測，建立畜禽組織食品中金剛烷胺殘留的分析方法，對(duì)雞肉、雞肝、豬肉、豬肝等畜禽組織食品進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290UPLC-6490A 超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent 公司；漩渦混合器VOATEX-2：Scientific Industries；SB5200 型超聲波清洗機(jī)：美國Branson 公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi 公司；氮吹濃縮儀：美國Organomation Associates 公司；分析天平：感量為0.1 mg：德國Sartorius公司。

金剛烷胺（Adamantanamine.1-（SG））：純度≥99%，ChromaDex Inc.；乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國Merk；無水硫酸鈉、冰乙酸為分析純；PSA（填料）、C18（填料）：粒徑40 μm，美國Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取2.00g 勻質(zhì)后的樣品，置于50 mL 帶螺旋蓋的聚丙烯離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，充分渦旋混勻，超聲提取25 min，搖勻后5 000 r/min 離心5 min，上清液待凈化。

1.2.2 凈化

將上述上清液轉(zhuǎn)移到凈化管中（10 g 無水硫酸鈉，400 mgC18，200 mgPSA），渦旋混勻，5 000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確移取5.0 mL 上清液至具塞刻度試管，于45 ℃水浴下氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL 定容液（30%乙腈水溶液含1%甲酸），超聲30 s，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測定。

1.3 儀器參數(shù)與測定條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：Proshell120EC-C18，3.0×100mm，2.7μm；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液；B：乙腈；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫條件：0～2.0 min，90%～85%A；2.0 min～4.0 min，85%A；4.0 min～7.0 min，85%～70%A；7.0min～8.0min，70%～10%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；源溫200 ℃；脫溶劑溫度為350 ℃；脫溶劑氣流速為11 L/min；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；監(jiān)測離子對(duì)及各優(yōu)化參數(shù)見表1。

表1 金剛烷胺的多反應(yīng)檢測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in MRM mode for amantadine

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化

乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時(shí)具有沉淀蛋白的作用，且其帶出的弱極性成分少，反應(yīng)在質(zhì)譜上響應(yīng)高、基質(zhì)影響小，因而選用乙腈作為提取溶劑。金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)中帶氨基，易溶于酸性試劑，在有機(jī)溶劑中添加一定比例的酸提取可顯著提高回收率[11-13]，故考慮向其中加入部分酸性溶液，本文考察了1%乙酸乙腈、3%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、3%甲酸乙腈4 種提取溶劑，進(jìn)行回收率對(duì)照實(shí)，結(jié)果見表2。

表2 不同提取溶劑對(duì)畜禽組織中金剛烷胺的回收率的影響Table 2 Effects on the recoveries of amantadine in livestock and poultry tissues with different extraction solvent

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用1%乙酸乙腈溶液作提取劑，提取時(shí)間為25 min，回收率較高，因此選擇1%乙酸乙腈為提取液。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

PSA、C18 是QuEChERS 方法常用的吸附劑。采用PSA 可有效去除乙腈提取液中脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素等成分，C18 具有良好的除脂能力，根據(jù)提取液中殘留脂肪和水分的含量特點(diǎn)，通過實(shí)驗(yàn)考查，見圖1，最終采用200 mg PSA、10 g 無水硫酸鈉及400 mg C18 為凈化劑組合進(jìn)行分散固相萃取，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率較佳。

圖1 不同凈化條件對(duì)金剛烷胺回收率的影響Fig.1 Effects on the recoveries of amantadine with different purification conditions

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為維持流動(dòng)相的低pH 保證金剛烷胺在流動(dòng)相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，本文擬采用0.1%甲酸或乙酸來控制流動(dòng)相的pH，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二者均可得到對(duì)稱、尖銳的峰形，但甲酸更利于金剛烷胺的離子化，可得到較高的檢測靈敏度，故實(shí)驗(yàn)中選擇用0.1%甲酸控制流動(dòng)相的pH，可以提高靈敏度，并且加入微量的NH4+可使峰型更尖銳、響應(yīng)更穩(wěn)定。最終本實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI 模式下對(duì)1.0 mg/L 的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描得到分子離子峰，再通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到子離子。金剛烷胺定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表2，在確定待測化合物監(jiān)測的母離子和子離子的基礎(chǔ)上，對(duì)各種待測化合物的噴霧電壓、毛細(xì)管溫度、鞘氣流速、電子管透鏡電壓、碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如實(shí)驗(yàn)部分所述。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

由于空白樣品基質(zhì)溶液于金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間處有基質(zhì)峰，本方法采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，很好的消除了基質(zhì)影響，完全能滿足殘留檢測的要求，見圖2。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

采用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，根據(jù)1.2 實(shí)驗(yàn)方法處理空白樣品，用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行定容、檢測，以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度作圖，實(shí)驗(yàn)表明，金剛烷胺在0.2 μg/L～100.0 μg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=14069.30×X，R2大于0.997?？紤]到基質(zhì)的復(fù)雜性及信噪比要求，經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定本方法的檢出限（LOD）為0.6 μg/kg，定量限（LOQ）為2.0 μg/kg。

圖2 雞肝空白基質(zhì)和基質(zhì)中加入金剛烷胺的MRM 譜圖（2.0 μg/kg）Fig.2 MRM Chromatograms of blank chicken liver and spiked in blank sample with amantadine（2.0 μg/kg）

2.6 回收率和精密度

選取具有代表性的樣品基質(zhì)：雞肉、雞肝、豬肉、豬肝，分別添加2.0、4.0、20.0 μg/kg 3 個(gè)水平濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平測定6 次，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率和精密度結(jié)果見表3。結(jié)果表明本方法的回收率范圍為70.5%～100.1%，RSD 值小于10%，本方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度，滿足分析要求。

表3 金剛烷胺的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of amantadine（n=6）

2.7 實(shí)際樣品測定

為驗(yàn)證該方法的可靠性，從超市購買了雞肉、雞肝、雞蛋、豬肉、豬肝、豬肉干，6 種畜禽組織進(jìn)行測定，同時(shí)作質(zhì)控樣品。樣品均未檢出金剛烷胺藥物殘留，質(zhì)控樣品的回收率等指標(biāo)均達(dá)到分析要求，表明結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本文建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測金剛烷胺的方法。采用酸化乙腈溶液提取后進(jìn)行分散固相萃取凈化，提高了提取效率，減少了雜質(zhì)干擾，快速簡潔。在優(yōu)化了提取和凈化方法的同時(shí)，采用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，很好地消除了基質(zhì)影響，提高了檢測靈敏度，適用于禽畜組織中金剛烷胺定性、定量分析。

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