郭 欣， 胡愛玲， 方霖楷， 劉 巖， 潘云峰△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1風(fēng)濕免疫科，2護(hù)理部，廣東 廣州510630)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，世界上約0.5%～1%的人群患有RA。滑膜炎癥細(xì)胞浸潤以及襯里層增生是其典型病理表現(xiàn)。襯里層增生的滑膜細(xì)胞可分為巨噬樣滑膜細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)。其中 RA-FLS 具有增殖程度增高、侵襲等類腫瘤特性，并發(fā)現(xiàn)多個與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，如絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、Wnt/β-catenin通路、核因子 κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)通路與磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)通路等，都與 RA的發(fā)病、關(guān)節(jié)破壞和疾病的進(jìn)程有著密切關(guān)系［1-3］。但目前有關(guān)其生物學(xué)特性及變化機(jī)制尚未清楚。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可整合營養(yǎng)、能量及生長因子等多種細(xì)胞外信號，參與細(xì)胞存活、增殖、分化等。mTOR共有mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物。mTORC2可磷酸化Akt的Ser473位點，是Akt激活的必要條件，并且與多種腫瘤細(xì)胞的幸存、增殖、遷移有關(guān)。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Akt通路在RA-FLS可被多種細(xì)胞因子激活，并參與減弱滑膜細(xì)胞對Fas引起的凋亡的敏感性［4］。而作為Akt激活的必要條件，目前尚未見mTORC2與RA的相關(guān)報道。RICTOR(rapamycin-insensitive companion of mTOR)為mTORC2特異性的組成蛋白，并是其發(fā)揮生物學(xué)作用的必不可少的組成部分［5］。本研究通過siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默RAFLS中RICTOR的表達(dá)，觀察mTORC2對細(xì)胞存活的影響。

材料和方法

1 標(biāo)本采集

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織來自2010年3月至2012年6月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行滑膜清理術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)，共7例，其中5個取自膝關(guān)節(jié)、2個取自髖關(guān)節(jié)。年齡25～62歲，平均40.1歲，其中6名女性。所有RA患者診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(American Rheumatism Association，ARA)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及高糖DMEM無血清培養(yǎng)基購自Thermo scientific;RNAiso Plus(總RNA提取試劑)、SYBR? Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)及 PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)均購自TaKaRa寶生物工程(大連)公司;總蛋白提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;靶I抗:兔抗人抗RICTOR多克隆抗體購自Cell Signaling;兔抗人抗磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體購自Bioworld;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記 II抗購自 Immunology Consultants Laboratory;噻唑藍(lán)(四甲基偶氮唑鹽)購自MP Biomedicals;無血清培養(yǎng)基 Opti-MEM I、脂質(zhì)體 Lipofectamine? RNAiMAX均為 Invitrogen產(chǎn)品。所需siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并化學(xué)合成，RICTOR的siRNA序列:正義鏈5'-GCGGUUAGCUUUAUUAAAUTT-3'，反義鏈 5'-AUUUAAUAAAGCUAACCGCTT-3';非特異siRNA(陰性對照)序列:正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 滑膜組織經(jīng)無菌條件下處理后，向滑膜組織滴加PBS緩沖液，將其銳性剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大小，將組織塊移至培養(yǎng)瓶中，加入適量10%FBS培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況及培養(yǎng)液的變化，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋底面＞80%時，可進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。經(jīng)消化傳代后獲得較純成纖維樣滑膜細(xì)胞。鑒定包括光學(xué)相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)和流式細(xì)胞術(shù)檢測CD55陽性細(xì)胞率。本實驗使用第3～5代滑膜細(xì)胞。

3.2 siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h用不含抗生素的10%FBS培養(yǎng)基消化接種細(xì)胞培養(yǎng)板，以每孔2×105個細(xì)胞接種于6孔板，以每孔2×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，使細(xì)胞融合度達(dá)50% ～80%時開始轉(zhuǎn)染。先用適量無血清培養(yǎng)基Opti-MEM I分別稀釋脂質(zhì)體及siRNA，并輕輕混合，室溫孵育10～20 min。將siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕前后搖動培養(yǎng)板混合，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，予10%FBS培養(yǎng)基換液，后繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育 19、43 和 67 h。

3.3 熒光定量PCR法檢測RICTOR mRNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染24 h后6孔板細(xì)胞每孔加入RNAiso Plus 1 mL，抽提細(xì)胞總RNA并溶于20 μL RNase-free H2O，取2 μL總RNA樣品于紫外分光光度計檢測A260/A280。按PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA依照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明書，行熒光定量 PCR反應(yīng)。

RICTOR上游引物序列5'-GCTAGGTGCATTGACATACAACA-3'，下 游 引 物 序 列 5'-AGTGCTAGTTCA-CAGATAATGGC-3';GAPDH上游引物序列5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，下 游 引 物 序 列 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。反應(yīng)體系總體積為 20 μL，含 cDNA 模板 1.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物、ROX Reference Dye 各0.4 μL，ddH2O 7 μL。使用 ABI PRISM? 7000，設(shè)置反應(yīng)程序:95℃ 30 s后，以95℃ 5 s，60℃ 31 s循環(huán)40次，95℃ 5 s，60℃ 31 s;反應(yīng)結(jié)束后分析各樣本Ct值，并計算 2－ΔΔCt值。

3.4 Western blotting分析 RICTOR的蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h、72 h后收集RA-FLS，用總蛋白提取試劑盒提取胞漿總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，用Western blotting檢測其胞漿中RICTOR蛋白表達(dá)的變化，即取30 μL總蛋白，經(jīng)8%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印到PVDF膜，封閉后加入Ⅰ抗(抗RICTOR 1∶500，抗 GAPDH 1∶5 000，取抗體稀釋液稀釋)，4 ℃搖床孵育過夜，加HRP標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000，取抗體稀釋液稀釋)孵育1 h，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)化學(xué)發(fā)光液，于暗室顯影后沖洗膠片。用Quantity One軟件進(jìn)行分析，讀取吸光度(absorbance，A)及A×mm2值，計算各樣本中RICTOR與內(nèi)參照GAPDH的吸光度值比較，以觀察特異性RICTOR siRNA轉(zhuǎn)染組與陰性對照組RICTOR蛋白表達(dá)量的變化。

3.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法 實驗分4組:①無細(xì)胞組:僅加培養(yǎng)液;②空白對照組:加培養(yǎng)液與RA-FLS;③陰性對照組:RA-FLS轉(zhuǎn)染非特異性siRNA;④特異性RICTOR siRNA組:RA-FLS轉(zhuǎn)染特異性RICTOR siRNA。處理24 h、48 h、72 h后向96孔板每孔細(xì)胞加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)液振蕩使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔A值，記錄結(jié)果，計算各樣本與無細(xì)胞組A值的差值(ΔA)，比較轉(zhuǎn)染非特異性siRNA與特異性RICTOR siRNA后RA-FLS細(xì)胞活力(陰性對照或特異性RICTOR siRNA組ΔA/空白對照組ΔA)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FLS培養(yǎng)的鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈細(xì)長紡錘形，胞核邊界清楚，卵圓形，居中，核仁明顯，與成纖維細(xì)胞形似，鑒定細(xì)胞形態(tài)與FLS相符，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)的第3代細(xì)胞顯示CD55表達(dá)陽性率達(dá)96.8%，見圖2，提示所培養(yǎng)的細(xì)胞大部分為FLS。

Figure 1.Morphology of RA-FLS observed under optical microscope(×100).Cells were slender and fibroblastlike，while nuclei were clear，ovoid and center.圖1 鏡下觀察第3代RA-FLS形態(tài)

Figure 2.CD55 expression of passage 3 RA-FLS detected by flow cytometry.A:blank control;B:CD55 positive.CD55 expression in this case was 96.8%.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代RA-FLS CD55陽性細(xì)胞率結(jié)果

2 轉(zhuǎn)染siRNAs后對RA-FLS RICTOR mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)RICTOR mRNA表達(dá)，Ct值經(jīng)過GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后，特異性RICTOR siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，對mRNA干擾效率為(78.36±3.71)%，與陰性對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 轉(zhuǎn)染siRNAs后對RA-FLS RICTOR蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 RICTOR siRNA 48 h、72 h后，RICTOR蛋白表達(dá)較陰性對照組明顯下降，沉默效率分別為(92.48±6.14)%、(98.57 ±1.40)%(n=7，P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.Expression of RICTOR protein in cytoplasm examined by Western blotting after transfection of RICTOR siRNA［RICTOR(－)］for 48 h and 72 h.Compared with control group，the expression of RICTOR was significantly decreased in RICTOR siRNA group.圖3 轉(zhuǎn)染siRNA 48 h及72 h后RICTOR的蛋白表達(dá)

4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染siRNA對RA-FLS活力的影響

轉(zhuǎn)染對RA-FLS活力呈時間依賴性，轉(zhuǎn)染24和48 h后，RICTOR siRNA轉(zhuǎn)染組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但轉(zhuǎn)染72 h后，RICTOR siRNA組的細(xì)胞活力為(90.14±1.90)%，顯著低于陰性對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 siRNA轉(zhuǎn)染不同時間后RA-FLS細(xì)胞存活力Table 1.The viability of RA-FLS after RICTOR siRNA transfection(%.Mean±SD.n=7)

討 論

mTOR存在于兩種多蛋白復(fù)合體—— mTORC1和mTORC2。mTORC1(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1)由mTOR、RAPTOR、mLST8和PRAS40組成，是PI3K/Akt/mTOR通路的重要組成，參與營養(yǎng)平衡、胰島素作用和細(xì)胞生存的調(diào)控。而mTORC2，即雷帕霉素不敏感復(fù)合體，由 RICTOR、mTOR、mSIN1和mLST8組成。其中，RICTOR是mTORC2的特異性成分，構(gòu)成mTORC2的支架蛋白。尚有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，用多等位基因打靶敲除的方法降低RICTOR在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)后，可以導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的增殖率下降，并降低了蛋白激酶Akt的活性和細(xì)胞的代謝能力［5］，提示 RICTOR還是 mTORC2發(fā)揮生物學(xué)作用必不可少的組成部分。目前認(rèn)為，mTORC2主要作用機(jī)制是參與了Akt/PKB第473位絲氨酸磷酸化，而通過降低RICTOR蛋白表達(dá)可影響mTORC2功能的發(fā)揮和Akt的磷酸化［6］。

Akt又稱PKB，即蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化一系列蛋白成分，抑制細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。其在人惡性腫瘤中通常高度激活，Akt異常激活意味著腫瘤細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)的耐受、細(xì)胞增殖生長代謝的異常增加，是目前癌癥研究的重要靶標(biāo)。已有研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Akt及Akt酶活性在RA-FLS中表達(dá)升高，并可抑制 TNF-α引起的凋亡反應(yīng)［7］;且Akt也參與了 TGF-β、fractalkine、lymphotoxin α 等細(xì)胞因子對RA-FLS促炎、增殖與抗凋亡的作用［8-10］。此外，Akt還被發(fā)現(xiàn)與RA軟骨破壞有關(guān)［11］，并在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫中有著關(guān)鍵地位［12］。以上均提示Akt的磷酸化在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，而安全有效的Akt通路抑制劑將可能成為RA治療研究的新方向。

如今對mTORC2的研究是腫瘤領(lǐng)域的焦點，但其信號通路的功能仍尚待研究。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，mTORC2參與了MMP-9活化并可通過PKC途徑影響細(xì)胞骨架參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，并激活A(yù)kt通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡［13］。另外，也有發(fā)現(xiàn)阻斷mTORC2通路，可促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖及轉(zhuǎn)移種植［14］;而該通路也被證實參與了乳腺癌細(xì)胞骨架變化，影響其趨化和轉(zhuǎn)移能力［15］。RA-FLS是滑膜中特殊的細(xì)胞群，RA發(fā)病后，其發(fā)生了腫瘤樣改變，表現(xiàn)為具有逃脫接觸抑制的能力，自主增殖程度增高，有侵襲的內(nèi)在特性。mTORC2是否也參與了RA-FLS的生長異常，目前尚未有相關(guān)報道。

本課題利用siRNA介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默RA-FLS中mTORC2的特異組成蛋白RICTOR的表達(dá)后，可顯著降低RA-FLS存活率，推測mTORC2可能參與了 RA-FLS的異常增殖或抗凋亡機(jī)制，為mTORC2信號通路在RA-FLS中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供線索。此外，實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA已開始影響mRNA翻譯，并在48 h后明顯抑制RICTOR蛋白表達(dá)。但RA-FLS細(xì)胞存活率在72 h后才出現(xiàn)顯著下降，考慮原因是:RICTOR的敲除并非直接抑制RA-FLS生長，它通過減少mTORC2復(fù)合物形成，影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而引起細(xì)胞凋亡或增殖減少，這可能與其抑制Akt磷酸化有關(guān)，但其下游通路仍有待進(jìn)一步實驗探索及證實。本實驗通過沉默mTORC2可抑制RA-FLS生長的發(fā)現(xiàn)，為RA發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供了新思路。

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