陳 燁， 周 軍， 袁婉麗， 莫利群， 胡節(jié)惠

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1中醫(yī)科，2麻醉科，四川瀘州646000)

肢體缺血再灌注(limb ischemia/reperfusion，LI/R)是臨床常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，可由斷肢再植、嚴(yán)重的肢體擠壓傷等因素引起。盡管為了挽救缺血肢體，恢復(fù)其血液循環(huán)是必須的，但研究表明肢體I/R可誘發(fā)肝、肺、腸及腦等器官損傷，從而誘發(fā)多器官衰竭(multiple organ failure，MOF)，最終導(dǎo)致死亡［1-4］，病死率極高，而且其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞先天性免疫細(xì)胞，在正常的大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞是靜止的，起著支持、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)、免疫和修復(fù)等作用。但當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被內(nèi)毒素、腦損傷等因素刺激后，能從靜止態(tài)變?yōu)榧せ顟B(tài)，成為阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放活性氧(reactive oxygen species，ROS)等神經(jīng)細(xì)胞毒性物質(zhì)。隨之小膠質(zhì)細(xì)胞能保持一種長(zhǎng)期活化的狀態(tài)，產(chǎn)生反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷［5］。肢體I/R能誘發(fā)動(dòng)物小膠質(zhì)細(xì)胞激活及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但能否導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，電針預(yù)處理對(duì)器官直接缺血再灌注損傷有防治作用［6-7］，但是否對(duì)肢體I/R導(dǎo)致的腦損傷具有保護(hù)作用還不完全清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察肢體I/R對(duì)大鼠生存率和認(rèn)知功能的影響及電針預(yù)處理保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)、健康成年雄性SD大鼠132只，體重255～300 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要藥品、試劑和儀器 多抗rabbit-anti-Iba1(Wako Pure Chemicals)，多抗 rabbit-anti-cleaved caspase-3(CST)，TUNEL 試劑盒(Roche)，大鼠 ROS、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。UV751GD紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Sunrise酶標(biāo)儀(Tecan)，Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)。DP70數(shù)碼相機(jī)Viewfinder 4.0圖像采集系統(tǒng)(Olympus)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型 參照既往文獻(xiàn)［3］的方法制備肢體缺血再灌注模型。10%水合氯醛30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，雙股三角處切開(kāi)皮膚，分離股動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動(dòng)脈3 h，再灌注48 h。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 132只大鼠隨機(jī)分為3組(n=44):假手術(shù)(sham)組:給予同樣的麻醉和操作，但只分離暴露股動(dòng)脈而不夾閉，不造成肢體缺血;肢體缺血再灌注(LI/R)組:夾閉股動(dòng)脈3 h，再灌注48 h;肢體缺血再灌注+電針預(yù)處理(LI/R+EA)組:建立模型前14 d開(kāi)始，連續(xù)行電針治療，穴位定位參照文獻(xiàn)［8］，選取百會(huì)、足三里及血海，1 d 2次。觀察術(shù)后7 d內(nèi)的生存情況(每組20只);每組另取8只大鼠，術(shù)前經(jīng)歷Morris水迷宮訓(xùn)練6 d后，在再灌注48 h進(jìn)行水迷宮測(cè)試。于再灌注48 h時(shí)，每組另取16只大鼠處死，其中8只用于腦水腫、氧化應(yīng)激及Western blotting檢測(cè)，另外8只用于免疫組織化學(xué)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察。如有術(shù)前測(cè)試異?；蛐g(shù)后未到觀察時(shí)點(diǎn)死亡，則排除本研究，重新補(bǔ)足動(dòng)物。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組大鼠均在術(shù)前連續(xù)6 d開(kāi)始Morris水迷宮訓(xùn)練。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)選擇一個(gè)象限的固定位置將大鼠置入水中，以入水起至找到平臺(tái)的時(shí)間為潛伏期，如120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s，則潛伏期記為120 s。其總行程為游泳距離，計(jì)算游泳速度，以評(píng)判大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。每天測(cè)試4次，啟動(dòng)監(jiān)測(cè)裝置，觀察并記錄動(dòng)物找尋平臺(tái)所需時(shí)間、游過(guò)的距離及游泳速度，取其平均值。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)每天第4次訓(xùn)練后撤除平臺(tái)，然后在原入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)其在120 s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，以評(píng)判大鼠的空間記憶能力。測(cè)試結(jié)束后即行手術(shù)。于再灌注后48 h再次行Morris水迷宮測(cè)試，取上述指標(biāo)平均值。

2.4 海馬形態(tài)學(xué)觀察 腦組織固定24 h后，經(jīng)梯度蔗糖脫水后，行冰凍切片制成30 μm厚的冠狀面切片，蘇木精 －伊紅(HE)染色，400倍光學(xué)顯微鏡(Olympus)下觀察海馬CA1區(qū)病理結(jié)構(gòu)并拍照，并計(jì)算正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

2.5 腦水腫測(cè)定 在手術(shù)顯微鏡觀察下，取出部分海馬組織，迅速吸盡表面水分，稱(chēng)取濕重后放入105℃恒溫烤箱中烘烤48 h后稱(chēng)取干重，計(jì)算腦組織含水量。含水率(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

2.6 ROS、MDA含量和MPO、SOD活性測(cè)定 取少量海馬組織，在冰浴中研碎，根據(jù)濕重補(bǔ)充加入生理鹽水制成10%組織勻漿，采用DCF法測(cè)定ROS含量，硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，髓過(guò)氧化物酶法測(cè)定MPO活性，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)及作者既往文獻(xiàn)［9］。

2.7 小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定海馬CA1區(qū)Iba1表達(dá)。冰凍切片加用相應(yīng)Ⅰ抗Iba1，4℃過(guò)夜孵育。洗滌后，滴加相應(yīng)Ⅱ抗，37℃水浴箱孵育30 min。洗滌后，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

2.8 Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western blotting法分析海馬CA1區(qū)中促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)水平。取少量海馬組織，提取蛋白及定量，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，兔抗 cleaved caspase-3多克隆I抗1∶1 000稀釋4℃下孵育過(guò)夜。然后使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)II抗室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯色，暗室內(nèi)用膠片壓片曝光，顯影。使用ImageJ軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像處理，測(cè)定灰度值。將同一張蛋白印跡膜曝光后，使用0.5%SDS洗脫抗體，加入βactin進(jìn)行孵育雜交以作為內(nèi)參照。

2.9 海馬細(xì)胞凋亡的觀察 采用TUNEL法分析海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況，37℃ proteinase K消化10 min，加入TdT反應(yīng)液37℃孵育90 min，加入TB緩沖液室溫15 min終止反應(yīng);HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育37℃ 1 h后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。400倍光鏡下隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.10 動(dòng)物存活時(shí)間的觀察 大鼠自由進(jìn)食、飲水，觀察各組大鼠再灌注7 d的生存率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 海馬組織形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下見(jiàn)sham組大腦海馬層次結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元排列齊、致密，胞核無(wú)固縮、變形，胞漿無(wú)水腫。LI/R組海馬組織損傷明顯，胞核固化、深染、溶解或消失，胞漿嗜酸性變，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則;LI/R+EA組損傷較輕，大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，少數(shù)神經(jīng)元胞核固縮，胞漿水腫。LI/R組及LI/R+EA組正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)均低于sham組(P＜0.05或P＜0.01);LI/R+EA 組高于 LI/R 組(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Histology of hippocampal CA1 region(HE staining，×400).Arrows indicate injured neurons.A:sham;B:LI/R;C:LI/R+EA.Mean ±SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05 vs LI/R group.圖1 各組光鏡下海馬形態(tài)學(xué)的變化

2 海馬cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的變化

與sham組比較，LI/R組及LI/R+EA組海馬cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)均顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)。與LI/R組比較，LI/R+EA組caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低，差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Expression of cleaved caspase-3 in hippocampus of rats.Mean ± SD.n=8.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖2 各組海馬cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)

3 凋亡指數(shù)的比較

TUNEL法檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，sham組海馬幾乎未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞;LI/R組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加;LI/R+EA組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與sham組比較，LI/R及LI/R+EA組細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著升高(P＜0.01);與LI/R組比較，LI/R+EA組細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P＜0.01)，見(jiàn)圖3。

4 腦組織含水量

LI/R及LI/R+EA組均高于sham組(P＜0.05或P＜0.01)，LI/R+EA組低于 LI/R組(P＜0.01)，見(jiàn)圖4。

5 小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)

Sham組大鼠海馬組織Iba1只有少量弱表達(dá)，LI/R組48 h時(shí)Iba1陽(yáng)性表達(dá)增加，與sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05或P＜0.01);與LI/R組比較，LI/R+EA組Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.Neuronal apoptosis(TUNEL staining，×400).TUNEL-positive cells(containing dark brown-stained nuclei)in the hippocampal CA1 region are indicated by arrows.A:sham;B:LI/R;C:LI/R+EA.Mean±SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖3 各組光鏡下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

Figure 4.Brain water content in hippocampus among the threegroups 48 h after LI/R.Mean ± SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖4 各組大鼠腦含水量的比較

6 海馬ROS、MDA含量及MPO、SOD活性變化

與sham組比較，LI/R及 LI/R+EA組 ROS、MDA含量及MPO活性增加，SOD活性減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與LI/R組比較，LI/R+EA組ROS、MDA含量及MPO活性降低，SOD活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖6。

7 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

與sham組比較，LI/R組及LI/R+EA組潛伏期及游泳距離延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或P ＜0.01)。與 LI/R 組比較，LI/R+EA組潛伏期和游泳距離縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖7。

Figure 5.Immunohistochemistry demonstrating microglia in the hippocampal CA1 region(ABC staining，×400).Iba1-immunopositive microglia are darkly stained and indicated by arrows in representative micrographs from sham(A)，LI/R(B)，and LI/R+EA(C)groups.Mean ±SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖5 各組光鏡下海馬小膠質(zhì)細(xì)胞變化情況

Figure 6.Changes of reactive oxygen species(ROS;A)，malondialdehyde(MDA;B)，myeloperoxidase(MPO;C)and superoxide dismutase(SOD;D)in rat hippocampus at 48 h after LI/R.Mean±SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖6 各組大鼠海馬ROS、MDA含量及MPO、SOD活性的比較

Figure 7.Latency to the platform(A)，swimming distance to platform(B)，the number of crossing the platform(C)and swimming speed(D)throughout the experiments.Mean ± SD.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs LI/R group.圖7 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試參數(shù)的比較

8 生存率比較

Sham組7 d內(nèi)無(wú)大鼠死亡，生存率為100%;LI/R大鼠于模型后7 d生存率為40%;電針預(yù)處理治療明顯提高LI/R大鼠的生存率，7 d生存率為80%(P ＜0.05 或 P ＜0.01)，見(jiàn)圖8。

Figure 8.Effects of electroacupuncture on survival rates of the rats after LI/R among the three experimental groups.n=20.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.圖8 電針對(duì)肢體缺血再灌注后大鼠生存率的影響

討 論

本研究成功復(fù)制了阻斷大鼠雙后肢3 h，再灌注48 h的肢體I/R損傷模型，光鏡下可見(jiàn)肢體I/R組海馬組織結(jié)構(gòu)不清，神經(jīng)細(xì)胞體積縮小，核固縮深染，胞漿嗜伊紅，同時(shí)正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)減少，提示海馬組織損傷嚴(yán)重;上述結(jié)果與既往研究［3］結(jié)果一致。同時(shí)本研究也證實(shí)肢體I/R能導(dǎo)致大鼠生存率下降及出現(xiàn)長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙，而電針預(yù)處理能改善上述異常變化，這表明電針對(duì)肢體I/R導(dǎo)致的腦損傷及認(rèn)知功能障礙有很大的臨床治療價(jià)值。

有大量研究［10-11］表明上述危重病患者即使經(jīng)治療存活下來(lái)，但因腦損傷而發(fā)生長(zhǎng)期性的記憶、認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)極大，嚴(yán)重影響患者的生活能力。與假手術(shù)組相比，肢體I/R大鼠需要較長(zhǎng)的平均逃避潛伏期和游泳距離，才能達(dá)到隱藏的平臺(tái)。3組之間游泳速度沒(méi)有差異，表明肢體I/R能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，但并不是由于損害大鼠的運(yùn)動(dòng)能力而造成的。然而，與肢體I/R組比較，電針預(yù)處理組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期及游泳距離更短，在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間及跨過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)增加。值得一提的是，電針預(yù)處理組和假手術(shù)組水迷宮測(cè)試結(jié)果差異很小，與組織形態(tài)學(xué)及其它指標(biāo)變化不太一致。目前導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因還不是很清楚，但有研究報(bào)道強(qiáng)制運(yùn)動(dòng)能改善學(xué)習(xí)和記憶能力［12］。因此，我們推測(cè)可能是重復(fù)水迷宮訓(xùn)練一定程度上提高了學(xué)習(xí)和記憶能力，加上電針對(duì)認(rèn)知功能障礙的治療作用，導(dǎo)致了電針預(yù)處理組和假手術(shù)組之間測(cè)試結(jié)果差異極小。

肢體I/R導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制是既復(fù)雜而又知之甚少。然而，肢體I/R損傷到大腦可能是氧化應(yīng)激的結(jié)果。由于神經(jīng)元的高代謝率，中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別容易受到過(guò)多生成的 ROS攻擊損害［13］。作為主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活時(shí)，能釋放ROS等神經(jīng)毒性物質(zhì)。既往研究表明腦I/R后發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，中性粒細(xì)胞聚集，釋放自由基等物質(zhì)，損傷神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，釋放促炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起更多的中性粒細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)，加重炎性反應(yīng)。MPO是中性粒細(xì)胞的特征酶，其活性可反映中性粒細(xì)胞的聚集程度［14］。另外，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的降解產(chǎn)物，測(cè)定其含量可反映過(guò)氧化的程度;而SOD為自由基清除劑，其活力則可反映內(nèi)源性氧自由基清除能力的高低，因此MDA和SOD可以反映體內(nèi)自由基的變化情況。本研究發(fā)現(xiàn)，給予肢體I/R損傷大鼠電針預(yù)處理能減少M(fèi)PO活性，提示電針預(yù)處理對(duì)損傷后中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)有抑制作用。同時(shí)還顯示，給予電針預(yù)處理后，氧化應(yīng)激指標(biāo)得到相應(yīng)改善，MDA減少，SOD活性得到提高，這與作者既往研究得出的兩者變化關(guān)系一致［15］;證實(shí)給予電針預(yù)處理可增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，能明顯抑制缺血再灌注后腦組織中自由基的產(chǎn)生，降低自由基對(duì)細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的破壞，從而發(fā)揮藥物對(duì)腦組織的保護(hù)作用。我們初步可以認(rèn)為電針預(yù)處理可以阻止海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕該部位氧化損傷。

總之，目前的研究表明肢體I/R能導(dǎo)致大鼠腦氧化損傷，認(rèn)知功能障礙及存活率下降。電針預(yù)處理可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕氧化應(yīng)激，從而改善肢體I/R誘發(fā)的上述相關(guān)影響。這表明，電針預(yù)處理作為一種神經(jīng)保護(hù)療法，在臨床中具有很大的實(shí)用性。

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