宋宏新， 李 韻， 薛海燕， 賀寶元

(1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

磁性微球是通過(guò)將磁性粒子與有機(jī)高分子結(jié)合，形成具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球.用它來(lái)進(jìn)行目標(biāo)物分離,具有操作簡(jiǎn)單、高效快速、可重復(fù)使用、保持靶物質(zhì)生物活性等特點(diǎn).磁性微球分離技術(shù)廣泛用于醫(yī)學(xué)抗癌導(dǎo)向、生物物質(zhì)分離及食品檢測(cè)等，是生物分離技術(shù)的一次革命，有力地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的發(fā)展[1-3].

磁性微球的制備方法主要有包埋法、單體聚合法、共沉淀法和化學(xué)沉淀法等[4].磁性微球的制備一直是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，高質(zhì)量磁性微球主要依靠進(jìn)口國(guó)外高價(jià)產(chǎn)品，大大限制了磁性微球在國(guó)內(nèi)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用[5].本研究在綜合比較各種制備方法的基礎(chǔ)上，研究了制備高質(zhì)量磁性微球的優(yōu)化工藝方法.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：液體石蠟(化學(xué)純)，相對(duì)密度0.835～0.855;Span-80(化學(xué)純)皂化價(jià)145～185；殼聚糖(BETTER)，脫乙酰度95.7%，分子量775 Kda，等電點(diǎn)為4.7；明膠(西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，約225水華，平均分子量50,000，每100 g有100～150 mmol羧基基團(tuán)，含水量13.7%，等電點(diǎn)為4.7～5.2；磁性粒子(南京共達(dá)納米應(yīng)用研究所)，F(xiàn)e3O4質(zhì)量百分比含量大于95%，平均粒徑20 nm左右，最大磁飽和強(qiáng)度為3千高斯；戊二醛(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，濃度為25%和50%；親和層析多克隆兔抗雞IgG(實(shí)驗(yàn)室制備).

儀器：752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；機(jī)械攪拌機(jī)(IKA)；掃描電鏡(S-2700，日本日立集團(tuán)).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 磁性微球的制備

(1)制備水相.稱取0.2 g明膠、0.3 g殼聚糖和0.1 g磁性粒子，加入10 mL蒸餾水，70 ℃水浴邊攪拌邊加入100μL冰醋酸，待殼聚糖和明膠完全溶解并與磁性粒子混合均勻后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到4.5～7.0[6]，得到2%明膠-3%殼聚糖-1%磁性粒子的復(fù)合溶液，室溫備用.

(2)油水乳化.向三口燒瓶中加入20 mL液體石蠟和0.6mL span-80,60 ℃恒溫水浴625 r/min攪拌混合30 min后,向其中逐滴加入5 mL水相樣品，進(jìn)行乳化.

(3)固化微球.乳化10 min后，同轉(zhuǎn)速下改換4 ℃冰浴，使乳液迅速降溫，使水相凝固初步定形成球.降溫2 min后逐滴一次加入0.5 mL戊二醛交聯(lián)30 min.逐漸升高水浴溫度到30 ℃，繼續(xù)固化反應(yīng)90 min[7-9].反應(yīng)結(jié)束后，乳液分別用石油醚、丙酮、異丙醇2 000 r/min反復(fù)洗滌后，避光自然晾干，得到褐色粉末.

1.2.2 磁性微球表征

(1)形貌表征.對(duì)磁性粒子進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)的拍攝，觀察殼聚糖/明膠磁性微球的大小、分散性和表面形貌.

(2)磁響應(yīng)測(cè)定.每0.02 g磁性微球溶于pH 7.0的蒸餾水中，低溫超聲振蕩混勻2 h，在磁力架上靜置30 min，清液在420 nm處測(cè)吸光度A.A<0.05為磁響應(yīng)良好[10].

1.2.3 磁性微球吸附BSA

按照表1，分別加入0.02 g/mL混勻的磁性微球溶液(pH7.0)、100μg/mL BSA和蒸餾水在1～6號(hào)離心管中， 37 ℃振蕩2 h使BSA充分吸附在磁性微球表面，用磁力架分離磁性微球30 min，取清液用考馬斯G250法測(cè)定595 nm處吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，確定BSA最佳加入量和吸附率[11].

表1 磁性微球?qū)SA的吸附

1.2.4 磁性微球吸附親和層析兔抗β-CNIgG

同樣地按照表1，僅將100μg/mL BSA換成層析純化多克隆兔抗β-CNIgG,其它操作同前，計(jì)算親和層析兔抗β-CNIgG最佳加入量和吸附率.

最佳親和層析兔抗β-CNIgG加入量和磁性微球進(jìn)行混合37 ℃振蕩反應(yīng)2 h，4 ℃放置6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后分別取清液，用考馬斯G250法在595 nm處測(cè)定吸光度，確定磁性微球?qū)贵w的吸附穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM電鏡

2.1.1 制備得到的殼聚糖/明膠磁性微球的SEM照.

如圖1(a)可以看到微球成球效果較好，表面光滑無(wú)凹陷，分散性好，球與球間粘連少.但也可以看到微球大小不夠均勻，制備方法還有待于改善；圖1(b)中微球表面光滑無(wú)凹陷，與標(biāo)尺比對(duì)得到制備的磁性微球粒徑在3～8μm之間.微球上出現(xiàn)了一些白色亮點(diǎn)，這是由于微球內(nèi)部磁性Fe3O4粒子與噴金表面有不同的電荷密度，電鏡對(duì)兩者感光度不同，使照片中微球上出現(xiàn)白色亮點(diǎn)，證實(shí)了磁性粒子被包裹在微球內(nèi)部.結(jié)果表明反相懸浮乳液包埋法可以制備形貌較好的磁性微球.

2.1.2 戊二醛濃度對(duì)殼聚糖/明膠磁性微球制備的影響

25%和50%的兩種不同濃度的戊二醛對(duì)比制備的磁性微球的SEM照片如圖2所示.

(a)600倍 (b)1000倍圖1 殼聚糖/明膠磁性微球的SEM形貌

(a)25%的戊二醛100倍 (b)50%的戊二醛100倍 (c)25%的戊二醛450倍 (d)50%的戊二醛450倍圖2 不同濃度戊二醛制備的殼聚糖/明膠磁性微球的SEM形貌

圖2(a)可以明顯看到25%戊二醛制備得到的磁性微球分散性較好，大小較為均勻，相比之下圖2(b)50%戊二醛制備的產(chǎn)物異形團(tuán)聚物較多，分散性不好；圖2(c)中25%戊二醛制備的微球成球性好、表面光滑粘連少；圖2(d)的產(chǎn)物成球性不好，非球形個(gè)體較多，箭頭所指處表面凹陷粘連嚴(yán)重.

結(jié)果表明，25%戊二醛制備得到的磁性微球形貌更好.

2.2 磁響應(yīng)效果

制備的磁性微球的磁響應(yīng)性是對(duì)其表征的重要指標(biāo)之一.選取了最優(yōu)制備條件下的3個(gè)樣品和3個(gè)溫度進(jìn)行磁響應(yīng)性的測(cè)定，結(jié)果如表2所示.

表2 殼聚糖/明膠磁性微球磁響應(yīng)性結(jié)果

從表2中可以看出,3個(gè)樣品在3個(gè)溫度的下吸光度A<0.05.其中，在4 ℃和20 ℃時(shí)，吸光度較低，表明磁性微球在低溫時(shí)磁響應(yīng)較穩(wěn)定；40 ℃時(shí)，吸光度略有升高，是因?yàn)椴糠治⑶蛑形唇宦?lián)的明膠在升溫后溶解，破壞了微球結(jié)構(gòu)，使其失去磁性粒子后漂浮于溶液中，溶液吸光度略有上升，但均未超過(guò)0.05，表明40 ℃時(shí)磁性微球穩(wěn)定性較好.

磁響應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備得到的磁性微球磁響應(yīng)效果好.

2.3 磁性微球吸附蛋白質(zhì)效果

2.3.1 吸附BSA

對(duì)3個(gè)磁性微球樣品進(jìn)行了BSA吸附效果的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示.

圖3顯示BSA加入量在0～40μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，吸附于磁性微球表面的BSA量，隨著B(niǎo)SA加入量增加而增加.當(dāng)BSA加入量為40μg/mL時(shí)出現(xiàn)了拐點(diǎn)，繼續(xù)增加加入量，吸附量趨于穩(wěn)定不再出現(xiàn)明顯增加.故40μg/mL為0.02 g/mL的磁性微球的最佳BSA加入量.通過(guò)公式：吸附率 =[(總加入量-上清液含量)/總加入量]×100%，可計(jì)算出BSA的吸附率為86.25%，吸附量為34.5±0.6μg/mL.

結(jié)果表明，制備得到的磁性微球?qū)SA有較好的吸附效果.

圖3 磁性微球?qū)SA的吸附情況

2.3.2 吸附層析兔抗β-CNIgG

對(duì)3個(gè)磁性微球樣品進(jìn)行了IgG吸附效果的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示.

圖4 磁性微球?qū)gG的吸附情況

圖4顯示IgG加入量在0～40μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，磁性微球?qū)gG的吸附量，隨著IgG加入量增加而增加.當(dāng)加入量在40～60μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，吸附量的增加不明顯，40μg/mL為曲線拐點(diǎn)，故40μg/mL為0.02 g/mL的磁性微球的最佳IgG加入量.同樣用吸附率公式可以計(jì)算出IgG的吸附量為19.6±1.0μg/mL吸附率為49.31%.

結(jié)果表明，制備得到的磁性微球?qū)gG有較好的吸附效果.

2.3.3 免疫殼聚糖/明膠磁性微球的時(shí)間穩(wěn)定性

免疫磁性微球的時(shí)間穩(wěn)定性結(jié)果如圖5所示.

圖5 時(shí)間變化對(duì)免疫磁性微球的穩(wěn)定性的影響

圖5顯示，靜置時(shí)間在0～24 h范圍內(nèi)，未吸附牢固的抗體進(jìn)入清液，清液中的IgG量隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加.在24～72 h范圍內(nèi)，清液中的IgG量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)增加不明顯，48 h時(shí)清液中IgG的增加量第一次低于總加入量的1%，可以認(rèn)為此時(shí)IgG與微球的吸附已經(jīng)趨于穩(wěn)定，48 h時(shí)IgG的吸附率為42.75%.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功制備得到了粒徑在3～8μm的表面光滑、分散性好的殼聚糖/明膠磁性微球.磁性微球穩(wěn)定性較好，在高速離心和靜置多日的情況下均未發(fā)生聚沉；25%戊二醛制備的磁性微球形貌較好；制備的磁性微球磁響應(yīng)在4 ℃和20 ℃下均良好；磁性微球?qū)SA有較好的吸附效果，0.02 g/mL的磁性微球最佳的BSA加入量為40μg/mL，吸附率可以達(dá)到86.25%；磁性微球?qū)游鐾每功?CNIgG有較好的吸附效果，最佳加入量為40μg/mL，吸附率可以達(dá)到49.31%；制備的免疫磁性微球在48 h后趨于穩(wěn)定，最終IgG吸附率為42.75%.

本試驗(yàn)制備磁性微球時(shí)，向油相中加入水相(磁粒子分散于殼聚糖/明膠溶液中)，通過(guò)調(diào)整兩相組分的比例，控制合適的攪拌速度是水相充分乳化穩(wěn)定的關(guān)鍵，其次是在固化交聯(lián)前對(duì)乳液快速降溫(4～7 ℃)使明膠凝固，使球體形狀初步固化成形，可以減少微球粘連和異形球體的出現(xiàn)；另一關(guān)鍵點(diǎn)是，戊二醛使殼聚糖分子間交聯(lián)，合適濃度的戊二醛理想情況是使球體表面交聯(lián)成殼，形成表面光滑、分散性較好的微球，濃度過(guò)大會(huì)使交聯(lián)過(guò)快出現(xiàn)球體表面凹陷、球體異形及球體間粘連等現(xiàn)象.

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)交聯(lián)劑進(jìn)行了研究，取得了階段性結(jié)論，其他影響乳化體系的復(fù)雜因素還值得進(jìn)一步探討.

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