蔡 琳 宋 卉 阮志燕

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary fibros，IPF）是一種慢性彌漫性肺間質(zhì)疾患，發(fā)病原因不明，組織學(xué)表現(xiàn)為尋常型間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pneumonitis， UIP）[1]。IPF是最常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺病，預(yù)后差，生存中值只有4年[1-3]。IPF主要發(fā)病人群年齡為50～70歲，分布沒有人種易感性，男性年發(fā)病率為7/10萬，女性年發(fā)病率為11/10萬[4]。IPF的組織學(xué)特征包括：肺泡上皮細(xì)胞不均一性的損傷活化、特征性的成纖維細(xì)胞灶存在和大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積[5]。雖然目前對其發(fā)病機制有一定的認(rèn)識，但是其病因和具體的細(xì)胞分子機制還未明了。值得注意的是，肺纖維化目前還缺乏有效的治療手段，患者最后的轉(zhuǎn)歸均為呼吸衰竭和死亡。

成纖維細(xì)胞灶的形成是IPF關(guān)鍵的病理改變，其主要效應(yīng)細(xì)胞是成肌纖維細(xì)胞[6]。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，損傷的肺泡上皮細(xì)胞通過上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是肌纖維細(xì)胞的主要來源[6]。EMT 的過程表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物的消失，轉(zhuǎn)而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白 α 平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）[7]。

α-SMA基因表達(dá)的異常激活與調(diào)控在肺泡上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中占有極為重要的地位，在EMT過程中細(xì)胞如何啟動和調(diào)控α-SMA基因的表達(dá)尚未明了。為了探討肺泡上皮α-SMA基因在肺纖維化微環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄激活，本課題組構(gòu)建了由α-SMA啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白報告載體，并在肺泡上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和定位。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞株、大腸桿菌DH5α、VSMp8質(zhì)粒（含小鼠α-SMA啟動子序列）由本校實驗室保存；質(zhì)粒微量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（優(yōu)晶公司）；紅色熒光蛋白報告質(zhì)粒空載體pDs-Red（Clontech公司）；限制性核酸內(nèi)切酶（寶生物公司）；Lipofactine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen 公司）；重組人 TGF-β1（R&D 公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Kodak公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-SMA啟動子紅色熒光報告載體pDs-Red-SMAp的構(gòu)建 已知α-SMA啟動子區(qū)是插入在質(zhì)粒VSMp8多克隆位點BamHⅠ和sphⅠ之間，用BamHⅠ和sphⅠ內(nèi)切酶酶切VSMp8得到啟動子序列，將其插入pGEM-7Zf質(zhì)粒的BamHⅠ和sphⅠ位點之間；然后用BamHⅠ和ApaⅠ內(nèi)切酶酶切再次得到α-SMA啟動子序列；繼而將啟動子序列亞克隆于pDs-Red的BamHⅠ和ApaⅠ位點之間；最終得到重組質(zhì)粒pDsRed-SMAp。重組子經(jīng)BamHⅠ和ApaⅠ雙酶切鑒定、測序鑒定無誤后，擴增備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)于5%的CO2、37℃人工培養(yǎng)箱。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天，將A549細(xì)胞以1.5×104/mL細(xì)胞密度接種于24孔板，待24孔培養(yǎng)板中細(xì)胞融合至70%～80%時，依照Lipofectine 2000轉(zhuǎn)染試劑的操作指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 實驗分組和TGF-β1刺激 實驗分為4組，A組：轉(zhuǎn)染對照空載體質(zhì)粒pDsRed組；B組：轉(zhuǎn)染對照空載體質(zhì)粒pDsRed+TGF-β1組；C組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pDsRed-SMAp組；D組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDsRed-SMAp+TGF-β1組。需用TGF-β1刺激的組，分別于轉(zhuǎn)染后12 h加入終濃度為10 μg/L的TGF-β1刺激4 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光蛋白表達(dá)。上述實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 pDsRed-SMAp重組載體的酶切鑒定

pDsRed-SMAp重組載體經(jīng)BamHⅠ和ApaⅠ雙酶切，凝膠電泳可見切出約4.1 kb和3.7 kb的兩個片段，所得酶切片段與設(shè)計相符（圖1）。

2.2 pDsRed-SMAp重組載體的測序鑒定

經(jīng)上海生工生物工程有限公司T7通用引物測序，結(jié)果與預(yù)期序列完全一致，DNA序列和讀碼框完全正確。

2.3 pDsRed-SMAp紅色熒光報告載體在上皮細(xì)胞中的表達(dá)

A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白表達(dá)空載體質(zhì)粒pDs-Red，在熒光顯微鏡下該組肺泡細(xì)胞中未觀察到紅色熒光蛋白（圖2A）。B組為轉(zhuǎn)染了空載體質(zhì)粒pDs-Red的細(xì)胞在TGF-β1刺激4 h以后，依然不能在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光 （圖2B）。C組細(xì)胞是轉(zhuǎn)染α-SMA啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白報告質(zhì)粒pDsRed-SMAp，在鏡下后可見到少量而微弱的紅色熒光，但是表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞呈顆粒狀，缺少正常細(xì)胞形態(tài)（圖2C）。D細(xì)胞在轉(zhuǎn)染α-SMA啟動子紅色熒光報告載體12 h后加TGF-β1刺激4 h，在熒光顯微鏡下則可觀察到細(xì)胞發(fā)出高亮度的紅色熒光，表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石狀貼壁生長，與正常的肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)一致（圖2D）。上述實驗共重復(fù)3次，結(jié)果一致。

3 討論

傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為特發(fā)性肺纖維化是由慢性炎癥引起的，因此予以皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒性藥物治療IPF，可以抑制炎癥造成的肺組織損傷，從而減輕和治療肺纖維化[8-9]。但是臨床治療表明，使用糖皮質(zhì)激素和細(xì)胞毒性抗炎治療對于IPF無明確的療效，并且許多確診為IPF的病例中發(fā)現(xiàn)其病理組織炎性反應(yīng)較輕微。近年來的研究表明，IPF的病理改變是由肺泡上皮細(xì)胞的損傷造成，反復(fù)的損傷刺激導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為表達(dá)α-SMA的成肌纖維細(xì)胞，發(fā)生EMT。成肌纖維細(xì)胞由于其表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，從而具有了收縮性，并且可以分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積在肺組織中，成為IPF的主要效應(yīng)細(xì)胞[10]。

TGF-β被認(rèn)為是誘導(dǎo)器官纖維化（包括肺纖維化）的“總開關(guān)”，是促EMT作用最強的細(xì)胞因子，可以啟動并完成整個EMT過程[10]。無論是離體實驗或在體實驗均證實，過表達(dá)的TGF-β能促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA，加重肺纖維化[11-13]。因此，深入研究TGF-β誘導(dǎo)作用下上皮細(xì)胞α-SMA的分子調(diào)控機制對闡明IPF過程中肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的病理機制非常重要。

紅色熒光蛋白 （red fluorescent protein，RFP）是?？蟹蛛x出來的一種生物發(fā)光蛋白，能夠在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光[14]。而本研究所采用的DsRed是Clontech公司商業(yè)化的一種低毒、低寡聚化及成熟快的紅色熒光蛋白突變體[15]。由于熒光蛋白基因可以在未受任何損壞的活體細(xì)胞中檢測其表達(dá)，DsRed被廣泛地應(yīng)用于報告基因的研究。報告基因技術(shù)是將一段順式調(diào)控序列插入報告基因上游以控制報告基因的表達(dá)，從而直觀地“報道”該順式調(diào)控序列的表達(dá)調(diào)控以及與其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活動[16]。DsReD具有很高的消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)量，用作報告基因具有熒光亮度高的優(yōu)勢；DsReD發(fā)射熒光的強度要比羅丹明B等染料和最好的GFP突變體高得多；DsReD具有較強的抵御光漂白的能力；另外，DsReD對pH值不敏感，pH范圍4.5～12時仍保持穩(wěn)定，這使其使用范圍更加廣泛。同時，DsReD除了可在活體細(xì)胞連續(xù)觀察的優(yōu)點，較少受到外來熒光干擾，靈敏度與信噪比高[17]。

本研究構(gòu)建的α-SMA啟動子紅色熒光報告載體pDsRed-SMAp是將α-SMA啟動子序列插入紅色熒光報告基因上游，通過紫外線激發(fā)檢測紅色熒光的強弱，從而示蹤α-SMA啟動子在活體細(xì)胞中的活化情況，對啟動子的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行評估。本研究將成功構(gòu)建的pDsRed-SMAp重組質(zhì)粒在人肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，在靜息的上皮細(xì)胞可見到少量而微弱的紅色熒光，但是表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞呈顆粒狀，缺少正常細(xì)胞形態(tài)，因此可以推測這些微弱的熒光并非由活體的上皮細(xì)胞發(fā)出，有可能是死亡細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光。說明在肺泡上皮細(xì)胞中缺乏α-SMA的表達(dá)，與既往研究結(jié)果一致。而在10 μg/L的TGF-β1刺激4 h后，可在熒光顯微鏡下觀察到由α-SMA啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白基因高水平表達(dá)，發(fā)出高亮度的紅色熒光，表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石狀貼壁生長，與正常的肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)一致。表明在TGF-β1的刺激下誘導(dǎo)了α-SMA啟動子活化，所構(gòu)建的α-SMA啟動子驅(qū)動的紅色熒光報告基因系統(tǒng)具有完整的細(xì)胞內(nèi)功能。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了α-SMA啟動子紅色熒光報告載體pDsRed-SMAp，具有穩(wěn)定性好、熒光持續(xù)時間長、不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及直接觀察等優(yōu)點，為研究肺纖維化EMT病理過程中α-SMA的基因調(diào)控提供了有效的工具。

[1]Gross TJ，Hunninghake GW.Idiopathic pulmonary fibrosis[J].N Engl J Med，2001， 345（7）：517-525.

[2]Gribben J，Hubbard RB，Le-Jeune I，et al.Incidence and mortality of idiopathic pulmonary fibrosis and sarcoidosis in the UK [J].Thorax，2006，61（11）：980-985.

[3]Bjoraker JA，Ryu JH，Edwin MK，et al.Prognostic significance of histo pathologic subsets in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Crit Care Med，1998，157（1）：199-203.

[4]Kim DS，Collard HR，King TE.Classification and natural history of the idiopathic interstitial pneumonias[J].Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：285-292．

[5]Kamp DW.Idiopathic Pulmonary fibrosis the inflammation hypothesis revisited[J].Chest，2003，124（4）：1187-1190.

[6]Willis BC，DuBois RM，Borok Z.Epithelial Origin of Myofibroblasts during Fibrosis in the Lung[J].Proc Am Thorac Soc，2006，3（4）：377-382

[7]De Wever O，Westbroek W，Verloes A，et al.Critical role of N-cadherin inmyofibroblastinvasionandmigrationinvitrostimulatedbycolon-cancer-cell-derived TGF-β or wounding[J].J Cell Sci，2004，117（20）：4691-4703.

[8]Mason RJ，Schwartz MI，Hunninghake GW，et al.Pharmacological therapy for idiopathic pulmonary fibrosis：past，present，and future[J].Am J Respir Crit Care Med，1999，160（5）：1771-1177.

[9]Katzenstein AL，Myers JL.Idiopathic pulmonary fibrosis： clinical relevance of pathologic classification [J].Am J Respir Crit Care Med，1998，157（4）：1301-1315.

[10]Futagawa T，Akiba H，Kodama T，et al.Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells [J].Int Immunol，2002，14（3）：275-286.

[11]Sime PJ，Xing Z，Graham FL，et al.Adenovector-mediated Gene Transfer of Active Transforming Growth Factor-β1 Induces Prolonged Severe Fibrosis in Rat Lung[J].J Clin Invest，1997，100（4）：768-776.

[12]Kalluri R，Neilson EG.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis[J].J Clin Invest，2003，112（12）：1776-1784.

[13]Yao HW，Xie QM，Chen JQ，et al.TGF-beta1 induces alveolar epithelial to mesenchymal transition in vitro [J].Life Sci，2004，76（1）：29-37.

[14]Matz MV，F(xiàn)radkov AF，Labas YA，et al.Fluorescent proteins from nonbioluminescent anthozoa species[J].Nat Biotechnol，1999，17（10）：969-973.

[15]Sumner JP，Westerberg NM，Stoddard AK，et al.DsRed a highly sensitive，selective，and reversible fluorescence-based biosensor for both Cu（+）and Cu（2+）ions[J].Biosens Bioelcctron，2006，21（7）：1302-1308．

[16]Massoud TF，Paulmurugan R，De A，et al.Reporter gene imaging of protein-protein interactions in living subjects[J].Curr Opin Biotechnol，2007，18（1）：31-37．

[17]Dmitrienko DV，Vrzheshch EP，Drutsa VL，et al.Red fluorescent protein DsRed：parametrization ofits chromophore as amino acid residue for computer modeling in the OPLS-AA force field[J].Biochemistry（Mosc），2006，71（10）：1133-1152.