楊謙謙，孫芳玲，艾厚喜，張麗，蔣瑩，王文

6-羥基多巴胺誘導帕金森病動物模型及其研究進展①

楊謙謙1,2，孫芳玲1，艾厚喜1，張麗1，蔣瑩1，王文1

帕金森病是中老年人常見的神經變性疾病。6-羥基多巴胺誘導類帕金森病的模型對研究帕金森病主要病理機制和治療藥物起重要作用。

帕金森?。粍游锬Ｐ停徊±頇C制；藥物治療；綜述

[本文著錄格式]楊謙謙，孫芳玲，艾厚喜，等.6-羥基多巴胺誘導帕金森病動物模型及其研究進展[J].中國康復理論與實踐, 2013,19(11):1006-1009.

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的神經系統退行性疾病，其主要病理改變是黑質致密部多巴胺神經元的大量丟失，臨床表現為靜止性震顫、肌張力增高、運動遲緩或減少、姿勢異常等。帕金森病嚴重影響患者的運動和生活能力，是一種致殘率高、病期長、給患者及其家庭和社會帶來沉重負擔的疾病。

幾十年來，對帕金森病的研究越來越受到關注。無論研究其發(fā)病機制，還是探索新的治療方法都離不開帕金森病實驗模型。目前建立帕金森病動物模型的方法主要有兩種：①將6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注入腦內黑質紋狀體系統或內側前腦束，損毀多巴胺能神經元，以制作大鼠、幾內亞豬、貓、猴、鳥類等動物帕金森病模型[1-2]；②用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl 4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyrid ine,MPTP)誘發(fā)靈長類動物(猴)和小鼠的帕金森病模型。盡管MPTP誘發(fā)猴的運動障礙與人相似，但局部解剖顯示，損傷與帕金森病患者不完全一樣，且MPTP損傷后有時可自發(fā)恢復。6-OHDA誘發(fā)的帕金森病模型動物來源廣泛(以大鼠最常用)，制作成本較低，行為學變化易于觀察且持續(xù)時間長，故目前在帕金森病的研究中應用最廣。其他如魚藤酮[3]，為容易透過血腦屏障的天然有機殺蟲劑，它對腦組織線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的活性具有強大而廣泛的抑制作用，選擇性引起黑質-紋狀體多巴胺(dopamine,DA)系統變性。

1 6-OHDA模型及其評估

1.1 6-OHDA模型

6-OHDA是神經遞質多巴胺的羥基化衍生物，于1959年首先被Senoh等成功分離，能高選擇地引起交感神經腎上腺素能神經末梢急性潰變。1968年，Ungerstedt的研究顯示，向黑質致密部注射6-OHDA能導致黑質紋狀體多巴胺系統順行性變性，從而生成第一個動物模型的制備[4]。

6-OHDA不能通過血腦屏障，需立體定向注入腦內。經典的方法是向黑質致密部、黑質紋狀體或內側前腦束注射，能夠產生巨大甚至完全的黑質多巴胺細胞體損傷。當6-OHDA注射至大鼠紋狀體后，可被多巴胺神經元末梢通過軸突逆轉運至黑質內的細胞體內；注射至大鼠黑質內時，6-OHDA與多巴胺競爭攝取位點，被攝取到細胞中。胞體的膜轉運體轉運6-OHDA到細胞內，經氧化生成神經毒物質，如羥自由基和醌類，破壞多巴胺神經元的抗氧化系統，線粒體功能損傷，膜穩(wěn)定性和DNA完整性破壞，細胞變性、死亡，黑質-紋狀體多巴胺系統功能減退，產生類似帕金森病的癥狀。

由于雙側注入6-OHDA后，往往因為吞咽障礙(aphagia)、渴感缺乏(adipsia)及運動不能(akinesia)等而使動物的死亡率極高[5]，所以6-OHDA對腦黑質-紋狀體系統的損毀通常為單側；單側注射內側前腦束能夠產生顯著地肌肉震顫行為[6-7]。使用不同劑量、不同濃度6-OHDA，損毀不同位點所制作的帕金森病大鼠模型不同。如第8周大劑量組(16 μg)比中劑量組(8 μg)和小劑量組(4 μg)在行為學上變化更明顯。當細胞丟失達70%時，帕金森病癥狀會更明顯；然而丟失40%時，能夠被觀察到一些重要的變化。增加注射劑量可以產生持續(xù)擴大的細胞丟失和行為學變化[8]。

1.2 評估

模型是否制作成功可用阿樸嗎啡旋轉測試。阿樸嗎啡是一種突觸后多巴胺受體激動劑；由于損毀側紋狀體內多巴胺受體密度上調，敏感性增強，出現去神經超敏感現象，故給藥后使損毀側多巴胺活動增強，導致帕金森病模型大鼠向損傷對側旋轉。通常給予0.2～0.5mg/kg阿樸嗎啡即可出現向對側旋轉的行為，共記錄30 min，若旋轉圈數＞7 r/min或＞210 r/30 min，則視為造模成功。

2 主要病理變化

帕金森病的神經退行性活動涉及的毒理機制有氧化應激、線粒體功能障礙、細胞凋亡、炎癥和影響神經元數量及放電等方面。

2.1 氧化應激反應

6-OHDA引起神經損傷的主要原因是毒素引起的大規(guī)模氧化應激。氧化應激能夠廣泛破壞脂質、蛋白質和DNA，導致多種機制的細胞死亡，包括不同的凋亡細胞信號分子的激活[9]。在生物體內，腦組織更易受氧化應激的損傷，因為大腦有大量、高濃度不飽和脂肪酸(脂質過氧化反應的底物)，又需要較多氧供，且自由基清除機制相對缺乏。通常，未經調節(jié)的活性氧使鈣的調節(jié)異常，細胞損傷和線粒體功能障礙，最終導致凋亡級聯酶激活，促進核轉錄因子-κB(NF-κB)激活并介導炎癥過程。

6-OHDA具有高親和力，通過和多巴胺競爭多巴胺轉運體而進入黑質-紋狀體多巴胺能神經元，在胞質內積聚并促使自動氧化，產生大量自由基，如H2O2、超氧化物和相應的醌。生成的大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)超出了多巴胺能神經元自身抗氧化清除能力，表現出神經毒作用。H2O2在Fe2+存在下發(fā)生Fenton反應，生成羥自由基(-OH)，攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸，造成脂質過氧化，從而損傷細胞。

2.2 線粒體損傷

線粒體功能障礙通過生成活性氧，也參與了氧化損傷和在細胞信號通路中導致細胞死亡。帕金森病藥物體外研究顯示，6-OHDA通過誘導線粒體破碎來破壞線粒體動力學。這時可通過對動力相關蛋白1(dynamin related protein 1,DRP1)從胞質遷移到線粒體來監(jiān)測線粒體裂變的激活[10]。

因為神經元細胞的代謝需要高能量，故更加依賴線粒體供能，線粒體損傷是神經退行性疾病的一大病因。有人報道，6-OHDA能直接抑制線粒體呼吸酶復合體Ⅰ(NADH脫氫酶)和復合體Ⅳ(細胞色素氧化酶)活性，從而抑制線粒體呼吸鏈的功能，導致細胞內ATP耗竭，引起細胞死亡。另外，由于氧化應激中NADH的消耗，致使發(fā)生在線粒體上的電子轉移受限，也可導致ATP合成減少。

2.3 誘發(fā)細胞凋亡

6-OHDA是神經毒素，通常誘導多巴胺通路損傷。研究發(fā)現，它通過抑制線粒體復合酶Ⅰ、釋放細胞色素C和凋亡誘導因子(AIF)、激活caspases-9和caspases-3、激酶信號調節(jié)機制、NF-κB介導的炎性反應來誘導細胞凋亡[9]。用6-OHDA誘導帕金森病模型鼠中腦黑質神經細胞凋亡，透射電鏡下可見模型組中腦黑質致密部部分細胞出現染色質致密或凝固成邊界清晰的塊狀物，有些出現核膜破裂，形成多個凋亡小體；對照組未見有此典型的凋亡形態(tài)學改變。最近研究顯示，6-OHDA可引起一氧化氮(NO)含量增加，在體外誘導pc12細胞凋亡；也可以通過細胞周期依賴性蛋白激酶5(cell cycle dependent protein kinase 5,CDK-5)介導的肌細胞增強因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)的高度磷酸化，引起MEF2D顯著下調，從而使pc12細胞死亡。這表明，由6-OHDA造成的細胞死亡和MEF2D下降依賴于CDK-5的活性。這種現象可以由CDK-5抑制劑加以保護，但6-OHDA產生的蛋白酶失活卻不能緩解[11]。

2.4 介導炎性反應

6-OHDA注入黑質紋狀體內出現的損傷與炎性反應有關，這在帕金森病的其他毒性模型(MPTP和魚藤酮)中也能觀察到，主要表現為小膠質細胞激活、巨噬細胞數量增加，它們在免疫監(jiān)視和即時免疫反應中扮演著重要角色。

激活的小膠質細胞釋放多種細胞因子，如白細胞介素-1β (interleukin 1β,IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)等，細胞因子水平在局部持續(xù)增高可誘導炎性反應，對多巴胺能神經元產生毒性作用，導致帕金森病。脂多糖/IFN-γ不僅可通過干擾素調節(jié)因子-1誘導小膠質細胞產生一氧化氮；還可誘導caspase-11表達，啟動小膠質細胞不依賴于一氧化氮的細胞凋亡。干擾素調節(jié)因子-1和caspase-11是小膠質細胞誘導細胞死亡的必需物質。因此，脂多糖/干擾素-γ激活小膠質細胞可對多巴胺能神經元產生毒性作用。

2.5 丘腦底核神經元放電和代謝活性的變化

除了黑質致密部病變，6-OHDA也對其他基底神經核的代謝活動產生影響。大量研究證實，紋狀體多巴胺去神經在基底神經節(jié)電路中能夠觸發(fā)一連串功能性改變，這最終導致丘腦底核(STN)功能的過度興奮。

在嚙齒類動物紋狀體內注射6-OHDA后，可觀察到一種細胞色素酶活性在腦半球的不對稱，它是一種線粒體酶，用于標記所有基底神經節(jié)核中神經元的代謝活性[12]。向黑質致密部微量注射6-OHDA制作選擇性損毀多巴胺神經元大鼠模型，結果顯示丘腦底核神經元放電頻率加快，且在損毀后的第6、8周顯著，呈爆發(fā)性放電的細胞數也較對照組明顯增多[13]。向大鼠內側前腦束(MFB)定量注射6-OHDA后，可觀察到蒼白球(GP)神經元內陽性小清蛋白(PV)的大量丟失，繼而活性減退，造成丘腦底核區(qū)過度活躍，從而引起運動不能[14]。也有研究顯示，大鼠紋狀體背側單側定量注射6-OHDA后28 d，腦免疫組化顯示，紋狀體背側和中央區(qū)的酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxy-lase,TH)陽性纖維密度減少41%，而腹側被蓋區(qū)無影響；逆行到黑質神經元(SN)，最嚴重的損傷發(fā)生在腹側區(qū)(55%)[15]。蒼白球背側和皮層扣帶區(qū)損傷明顯，產生嚴重的多巴胺能神經軸突損傷，這可能是造成帕金森后遺癥的原因之一。

2.6 細胞內Ca2+超載

由于線粒體呼吸抑制可造成多巴胺能神經元能量供應障礙，導致線粒體Ca2+轉運系統功能下降，胞漿內Ca2+濃度上升，激活磷酸酶和蛋白酶等降解酶，使細胞膜和細胞骨架降解，從而損害細胞功能并間接損傷細胞。另外，谷氨酸受體在異常情況下被過度刺激，也可造成胞外Ca2+過度內流，導致細胞內Ca2+超載。Ca2+濃度升高造成一些鈣依賴性酶活性增加，包括一氧化氮合酶(NOS)，致使細胞內一氧化氮含量增加，而一氧化氮又可與超氧陰離子(O2-)結合形成過氧化亞硝酸離子(ONOO-)，造成多巴胺能神經元損害；另一方面，O2-可在Cu、Fe離子存在的情況下，轉化為H2O2，并進一步形成-OH，最終也造成對多巴胺能神經元的損害。

3 新藥開發(fā)中的應用

3.1 抗氧化應激

最近研究發(fā)現，防止多巴胺神經元氧化應激的一個策略是使用植物化學物作為誘導劑，產生內源性抗氧化劑和第二期的酶。異硫氰酸酯(ER)是一種十字花科類提取的化合物，能夠使總谷胱甘肽(GSH)含量增多，總抗氧能力增強，增大細胞內神經元抗死亡能力，減少細胞凋亡[16]。α-硫辛酸(LA)是一種強抗氧化劑，發(fā)現于線粒體，參與其代謝，具有神經保護和抗凋亡作用，能顯著改善6-OHDA造成的對側旋轉行為，是治療由6-OHDA造成的線粒體功能障礙和氧化應激的潛在藥物[17]。已證實其對由魚藤酮造成的帕金森病模型有神經保護和抗凋亡作用。向內側前腦束內注射6-OHDA造成黑質多巴胺系統完全損毀，口服沒食子酸(GA)能顯著改善6-OHDA造成的被動回避記憶降低，總硫醇和谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化劑的含量也有所增加，并降低了丙二醛在海馬和紋狀體的含量[18]。

3.2 抗線粒體損傷

目前正在研究針對線粒體的抗氧化劑，如MitoQ、半胱氨酸[19]，防治線粒體氧化性損傷和改變活性氧在信號通路中的參與。證據顯示，小分子抑制劑在治療帕金森病線粒體裂變的潛力，可減少線粒體裂變和自噬細胞的數量[20]。有文獻報道，雷帕霉素，一種抗生素，在減少氧化應激和保護線粒體方面起著關鍵作用。雖然其機制尚未明確，但用于動物模型的結果顯示，它能夠防止多巴胺能神經元損失，減輕線粒體超微結構損傷，使過氧化氫水平降低，抗氧化活性增高[21]。

3.3 抗細胞凋亡

體外研究顯示，姜黃素Ⅰ，一種從姜黃中提取的純化合物，能夠阻止6-OHDA對多巴胺神經元產生的毒性，減少活性氧的生成，顯著降低P53的磷酸化水平，減少細胞凋亡，具有神經保護活性[22]。由6-OHDA造成的細胞死亡和MEF2D下降依賴于CDK-5的活性，所以可以用CDK-5抑制劑對多巴胺神經元加以保護[11]。證據顯示，食用抗氧化食物，如螺旋藻中提取的有效成分，也能有效減少自由基產生，抑制脂質過氧化和調節(jié)抗氧化酶系統，防止細胞凋亡[23]。橄欖葉提取物(OLE)和橄欖苦苷對6-OHDA誘導pc12細胞的凋亡有抗氧化保護作用，已被世界范圍內的人們作為飲料添加劑使用，以期改善患者的健康[24]。

3.4 抗炎性反應

主要是從抑制炎性因子的生成和神經保護方面著手。目前研究的關于炎性介質的神經保護藥物，如羅格列酮，能夠明顯阻止TH蛋白表達的降低，抑制小膠質細胞激活，減少環(huán)氧合酶-2(COX-2)和TNF-α的合成[25]，有效減少多巴胺損耗。普羅布考，一種低脂酚類化合物，具有降脂、抗炎和抗氧化活性，最近報道在神經毒性和神經退行性模型中被用作保護劑[26]。

4 展望

6-OHDA帕金森病大鼠模型為探討帕金森病的發(fā)病機制及藥物療效判定、細胞移植治療、基因治療、神經保護治療方面的研究提供了必要的實驗基礎，在病理、行為學等方面的表現與人類有不少相似之處。但此模型仍屬急性損傷模型，也沒有細胞內Lewy小體的表現，這與人類帕金森病有一定差異。故不太符合患者自然病程較長、病情進展緩慢、黑質多巴胺進行性退變的特點。因此如何從分子、細胞、整體三方面實現機能與形態(tài)研究的相互對應，找到動物、藥物、劑量、靶位、方法等多因素作用的完美結合，全面地反映帕金森病病因、病機、病理、病程等特點；如何利用現代影像學技術、信息化處理手段來全程記錄和定量分析去除人為因素的干擾，將是帕金森病動物模型進一步探討的問題。

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Model of Parkinson's Disease Induced with 6-hydroxydopamine:Modeling and Pathology(review)

YANG Qian-qian,SUN Fang-ling,AI Hou-xi,et al.Department of Pharmacology,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China

Parkinson's disease is a common progressive neurodegenerative disorder among old people.Parkinson's disease model induced with 6-hydroxydopamine has been used to research pathology and medication of Parkinson's disease.

Parkinson's disease;animal model;pathology;medication;review

R742.5

A

1006-9771(2013)11-1006-04

2013-03-14

2013-04-16)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2012ZX09102-201-016)；2.國家自然科學基金(No.81173575)；3.北京市自然科學基金(No.7062031)；4.北京市教委科技創(chuàng)新平臺項目(No.111219)；5.2011年北京市衛(wèi)生系統高層次衛(wèi)生技術人才培養(yǎng)計劃項目(No.2011-3-097)；6.中國博士后基金(No.106455)。

1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市100053；2.河北北方學院，河北張家口市075000。作者簡介：楊謙謙(1988-)，女，漢族，河北邢臺市人，碩士研究生，主要研究方向：神經藥理。通訊作者：王文。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.002