王 衡，寧章勇，梁煥斌，古洪浪，張桂紅

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州510642）

2003年，有報道稱日本發(fā)現(xiàn)兩例戊型肝炎（Hepatitis E，HE）感染病例，1例53歲患者盡管早期出現(xiàn)嚴重的肝炎癥狀，但很快恢復健康；另1例70歲患者出現(xiàn)同樣的初期肝炎癥狀，但隨后出現(xiàn)肝昏迷并死亡于突發(fā)性肝衰竭。病原分離得知兩例患者感染的為Ⅳ型肝炎病毒；流行病學調查表明，在3個月內2人共同食用5次未熟的野豬肝［1］。另外，香港明報新聞網 （http：／／www．chinanews．com／ga／2010／12－30／2758109．shtml）在2010 年年末報道了這樣一則新聞，稱香港食物安全中心表示，香港的戊型肝炎由1998年起逐漸上升，至2010年已達100宗，數(shù)字為歷來的新高?；颊咄ǔＳ邪l(fā)燒、嘔吐、眼黃及尿液呈茶色等病征，報道同時指出，戊型肝炎患者多曾去過高危地方，或曾食用貝或豬肝等食物，以致染病。雖然兩則報道相距7年，但在這7年里，世界各地尤其是發(fā)展中國家類似的報道數(shù)不勝數(shù)。這提示我們戊型肝炎病毒正隱蔽在家畜、家禽及野生動物體內，并悄悄地“潛伏”在我們周圍。

戊型肝炎是引起暴發(fā)性及散發(fā)性肝炎的主要原因，血清學調查表明［2］，世界1／3人口曾經感染過戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）。無論是在發(fā)展中國家還是在發(fā)達國家，戊型肝炎都不再是一種罕見的疾病，在發(fā)達國家每年約有1．3萬～2．6萬人慢性肝炎患者因合并HE死亡［3］。戊型肝炎具有比較明顯的年齡特異性，對于老年人、慢性肝炎患者及孕婦危害性尤高，孕婦感染HEV的死亡率可達20%［4］。眾多研究表明，豬HEV可能是人感染HEV的主要來源之一，因此，積極開展動物源性HEV的研究將會對公共衛(wèi)生及動物源性食品安全的實施具有巨大的幫助。

1 豬戊型肝炎病原學與流行病學

HEV屬于單股正鏈RNA病毒，是戊肝病毒屬的惟一成員。目前已經鑒定出兩種截然不同的HEV，一種是感染哺乳動物的HEV，包括4個基因型，可以引起人類的急性肝炎，目前認為豬及其他多種動物可能作為其重要的儲存器；一種是感染禽類的HEV，只含有1個基因型，可引起雞出現(xiàn)肝脾腫大癥狀。其中前者，被認為可能是一種豬源的人獸共患病，也是目前動物源性人獸共患病的研究熱點之一，該病毒具有一個7．2kb的基因組，含有3個開放閱讀框（ORFs），分別為編碼具有復制功能的多聚蛋白的ORF1、編碼病毒衣殼蛋白的ORF2以及編碼具有調節(jié)細胞蛋白激酶活性的ORF3。

根據(jù)病毒基因的變異性，我們將感染哺乳動物的HEV分為4個基因型［5］：分別是以亞洲和非洲分離株為主的Ⅰ型；以墨西哥株及少量非洲散發(fā)疫區(qū)分離株為主的Ⅱ型；以分離自發(fā)達國家并可以是人源或豬源分離株為主的Ⅲ型；以亞洲分離株為主，尤其是主要發(fā)現(xiàn)于中國及日本的基因型Ⅳ型。

目前在我國大部分地區(qū)［6－8］，不但在人群中可以檢測到高比例HEV陽性血清的存在，同時在家畜（豬、馬、牛、羊）及寵物（犬）體內同樣可以發(fā)現(xiàn)高比例的HEV陽性血清，特別是在豬群中感染率尤為明顯，但HEV RNA陽性率卻遠遠低于其血清陽性率。通過對我國分離到的病毒測序比對發(fā)現(xiàn)，無論是人源還是動物源的HEV大多數(shù)屬于Ⅳ型。而且對我國東部及南部的分離株分析發(fā)現(xiàn)，豬HEV與人HEV具有較高的相似性。因此有學者推測，豬可能是HEV重要的儲存器［9］，并通過污染水源［10］和食品［11］，作為一種人獸共患病病原在豬群及人群中自由傳播。通過對我國部分地區(qū)，如我國上海、北京、湖南、廣西及內蒙古等西部省份不同豬群調查表明，不同日齡、不同養(yǎng)殖方式的豬群中HEV陽性血清均維持在一個較高水平，3月齡以上豬群感染率高于三月齡以下豬群［4］，散養(yǎng)豬群血清陽性率尤高，在北京部分散養(yǎng)豬群中陽性率可達90%以上［12］。因此可以推斷，我國大多數(shù)地區(qū)的大多數(shù)豬群均有過HEV的感染經歷，而且部分豬群正處于隱性感染階段。

盡管自然感染HEV豬群很少出現(xiàn)典型的臨床癥狀或發(fā)病，但我國不同豬群HEV高感染水平的現(xiàn)狀我們不能夠忽視，因為豬群具有潛在的作為HEV儲存器的能力。同時有研究表明，豬HEV可能跨種間傳播給人類，因此針對豬HEV的展開深入的研究，對于公共衛(wèi)生、器官移植及動物源性食品安全有著重要的意義。

2 豬戊型肝炎診斷方法

豬HEV具有跨宿主傳播給人類的可能，對該病毒進行及時有效的診斷十分重要。目前實驗室常用的豬HEV診斷方法有PCR、ELISA、免疫組化、原位雜交及其他分子生物學和免疫學方法。

2．1 用于豬HEV檢測的PCR方法 由于豬HEV屬于單股正鏈RNA病毒，因此實驗室最早采用RT－PCR方法進行該病原的檢測，Huang等［13］針對病毒ORF2段基因設計引物擴增出大小為392 bp的產物，用于RT－PCR的檢測，該方法不但可以進行的病原的檢測，而且序列分析表明，美國豬HEV流行株與美國人HEV流行株具有高于79%的相似性。另外一種PCR方法為巢式RT－PCR（nRT－PCR），Choi等［14］最早設計兩對引物對福爾馬林固定的肝臟進行了豬HEV的檢測，試驗方法具有很好的特異性，目前該方法在很多實驗室中被廣泛應用。隨著實時定量PCR方法（Real－Time PCR）的不斷改進和完善，在豬HEV檢測技術中又相繼出現(xiàn)了 SYBR GreenⅠReal－Time PCR［15］和TaqMan Real－Time PCR［16］方法，這些方法不但有高于nRT－PCR的靈敏性，而且可以用于多重檢測方法的建立。為建立一種靈敏可視化PCR檢測方法，本人所在研究團隊建立了環(huán)介導等溫擴增技術（Loop－Mediated Isothemal PCR，LAMP）用于該病毒的檢測，試驗方法具有與nRT－PCR相同的靈敏性，可有效的用于臨床樣品的檢測（研究結果未發(fā)表）。

2．2 用于豬HEV檢測的ELISA方法 由于HEV病毒血癥持續(xù)的時間較短，在流行學病調查中單獨使用PCR檢測結果，會造成結果的片面性，因此常常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）用于HEV抗體的檢測，以對PCR檢測結果進行補充。Engle等［17］將豬HEV和人HEV重組ORF2蛋白用于ELISA方法的建立，盡管二者在氨基酸序列上存在5%的差異性，但試驗結果表明，二者可同時用于豬和人HEV抗體的檢測，這表明兩種HEV在OFR2段可能存在相同的抗原決定簇。Hu等［18］通過對豬HEV ORF2基因進行序列分析，發(fā)現(xiàn)在其394～660bp之間集中存在病毒的構象表位，因此將其表達后包被于固相載體上，并結合應用該蛋白過氧化物酶標記產物，建立了雙抗原夾心ELISA檢測方法用于HEV抗體的檢測，該方法不但具有較強的靈敏性和特異性，而且可以用于HEV感染后14d血清的檢測。另有研究表明，應用Ⅲ型HEV桿狀病毒重組衣殼蛋白也可以有效地用于其血清的檢測［19］。

目前，國內有使用國外進口豬HEV ELISA試劑盒用于國內豬血清檢測的報道，國外ELISA試劑盒中包被抗原多為Ⅱ型或Ⅲ型HEV，與目前國內主要流行Ⅳ型HEV在基因型存在較明顯的差別。雖然國外進口豬HEV ELISA試劑盒用于國內豬血清檢測時可以檢測到陽性血清的存在，但其結果是否能夠客觀反映流行水平，還有待進一步討論。

2．3 用于豬HEV檢測的免疫組織化學和原位雜交方法 免疫組織化學法和原位雜交檢測方法可以用于檢測病原的組織分布，甚至檢測其在細胞內的定位。Chio［20］等人首先應用一段長度為289bp的地高辛標記的cDNA探針對自然感染HEV病豬的肝臟及其他組織進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，在肝臟及膽管內可以見到陽性信號的分布，同時在小腸、大腸、脾臟、淋巴結、扁桃體及腎臟中也發(fā)現(xiàn)了陽性信號的分布。Ha等［21］最早應用免疫組化方法對PCR檢測為陽性，且為福爾馬林固定的自然感染病例樣品進行了HEV的檢測，檢測結果與Chio得到結果一致。二人的研究結果表明，豬HEV主要分布于肝臟的肝細胞，同時在肝外組織也可以見到少量的分布。另有研究應用原位雜交技術表明，在變性及空泡化的肝細胞內不能發(fā)現(xiàn)雜交信號的存在［22］，這提示我們HEV感染豬后僅能引起肝細胞發(fā)生輕微的病理變化，并使其處于亞臨床癥狀階段。

2．4 其他方法 HEV是一種基因型比較復雜的病毒，不同國家和地區(qū)的不同毒株都可能存在一定差異。對湖南豬HEV流行毒株進行序列分析結果表明，多數(shù)屬于Ⅳ型，但也存在其他基因型的可能［7］。一直以來多應用序列分析的方法進行分子流行病學分析，這種方法稍顯費時費力。針對這種情況，并結合HEV基因特點，Sun等［10］采用異源雙鏈遷移分析方法（heteroduplex mobility assays，HMA）用于區(qū)分豬HEV野毒株和參考毒株，這種方法不但適用于HEV分子流行病學的測序前調查，對于其他基因型復雜的病毒應該同樣有效。另外，在檢測方法方面，本研究團隊最近建立了免疫過氧化物酶單層細胞試驗方法（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA），將穩(wěn)定表達 HEV ORF2蛋白的細胞系包被于固相載體上，用于其抗體的檢測，該方法在實驗室應用取得了較好的效果（研究結果未發(fā)表）。

3 豬戊型肝炎病毒感染模型及感染途徑

目前無論是人HEV還是豬HEV研究面臨的最大問題是，還沒很好細胞系能夠對其進行穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)。但最近有研究顯示［23］，豬和人的某些細胞系能夠用于豬Ⅳ型HEV的傳代，研究結果表明，用豬肛門拭子和肝臟接種豬腎細胞系（IBRS－2）和人肺癌細胞（A549），當IBRS－2傳代至第8代、A549傳代至22代時，可以見到細胞病變的出現(xiàn)，該研究結果為今后HEV體外試驗的開展提供了重要信息。

體內試驗對于HEV的研究同樣重要，盡管目前獼猴可以用于HEV的研究［24］，但由于猴子飼養(yǎng)難度較大，大多數(shù)實驗室還無法正常采用。為尋找獼猴的替代動物，有人使用蒙古沙鼠（Mongolian gerbils）作為動物模型開展的Ⅳ型HEV的研究，試驗結果表明，該實驗動物通過腹膜內感染病毒后，病毒血癥和糞便排毒可以持續(xù)接近4周，同時在腸道和肝臟內檢測到病原的存在［25］。

深入了解HEV的傳播途徑對預防、控制病毒的傳播和擴散有著重要的意義。在實驗室中靜脈注射途徑是一種比較廣為使用的辦法，同時有人還采用肝內接種的辦法，這兩種感染途徑都可以獲得很好的感染效果。但在自然情況下HEV會以哪種途徑進行相互感染呢？有研究表明［26］，“糞－口”傳播是一種重要的方式，而通過“針頭”和扁桃體進行傳播的可能性則較小。另有試驗指出，當豬口服含有適量病毒的膽汁時，可以使部分實驗動物感染病毒，更重要的是還可以使與之直接接觸的“哨兵”動物感染［27］。以上這些信息提示我們，做好糞便清理工作和及時隔離疑似動物，對做好HEV的防控尤為重要。

4 小結

豬HEV是一種發(fā)現(xiàn)比較晚的病原，盡管國內外學者對其進行長期的研究，但仍留給我們較多的空白，例如主要抗原表位的分布、免疫機制與致病機制的具體途徑等。開展豬HEV研究最重要的原因是，該病原可以在多種動物之間傳播［28］，尤其是可能跨宿主感染人類，并在一些人群中出現(xiàn)高水平的致死率。預防該病原在人豬之間以及人與其他動物之間相互傳播的關鍵環(huán)節(jié)是控制傳染源并切斷傳播途徑。研究表明，帶毒動物可以通過糞便污染水源及水生生物，進一步傳播給人類。因此，如何加強動物糞便的管理，如何提高水質監(jiān)測水平，以及如何避免食品源性動物受到病毒的污染，對今后的研究和監(jiān)管都顯得格外重要。由于豬感染HEV較少發(fā)病，因此豬HEV疫苗的研究始終沒有明顯的進展，但可喜的是人HEV疫苗研究已經進入了3期臨床試驗階段，并取得了很好的效果［29］。在器官移植研究中有人嘗試使用豬的器官替代人的器官，因此豬HEV給異源器官移植同樣帶來了潛在的危險。但隨著HEV診斷技術的不斷優(yōu)化、傳播途徑不斷明確以及相關疫苗的研發(fā)，我們有理由相信，HEV在不同種屬動物之間的傳播會得到有效的控制，豬HEV在公共衛(wèi)生、食品安全以及器官移植等領域帶來的問題會得到合理的解決。

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