曾含漪 徐仁伵

(南昌大學醫(yī)學院，江西 南昌 330006)

肌萎縮側索硬化(ALS)是一組病因未明確致命性的選擇性侵犯脊髓前角細胞、腦干運動神經核、皮質錐體細胞和錐體束的進展性的神經退行性疾病，既有上運動神經元受損，又有下運動神經元受損，表現(xiàn)為肌無力、肌萎縮、延髓麻痹與錐體束征。發(fā)病機制至今未明，隨著對ALS疾病的研究深入，ALS運動神經元選擇性損傷的發(fā)病機制可能有:Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變，谷氨酸毒性學說，線粒體功能障礙，免疫炎性反應，星形膠質細胞功能異常，TAR DNA結合蛋白43(TDP-43)和肉瘤融合蛋白(FUS)包涵體等。

1 SOD1基因突變

SOD1基因編碼的SOD1能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，阻止超氧化物與一氧化氮(NO)反應形成過氧化亞硝酸陰離子。SOD1可通過依賴銅伴侶分子(CCS)及非依賴銅伴侶分子兩種途徑激活，最開始認為SOD1的突變導致SOD1功能缺失引起ALS發(fā)病，但后來研究發(fā)現(xiàn)，刪除SOD1基因的小鼠不表現(xiàn)為ALS〔1〕，且刪除CCS基因的動物模型也不發(fā)病〔2〕。這表明，SOD1突變導致的不是功能缺失性毒性，而是一種功能獲得性毒性。SOD1的功能獲得性毒性可通過它的錯誤折疊、聚集來導致細胞的損害。

未被金屬修飾的不成熟的SOD1的解鏈溫度較低，較易發(fā)生錯誤折疊，同時，錯誤折疊的SOD1蛋白又易與DNA或其他蛋白結合形成容易錯誤折疊的新的化合物。研究表明，神經元周圍的神經膠質細胞等也會分泌一些物質造成一個促進SOD1錯誤折疊的環(huán)境〔3〕。野生型SOD1若缺乏金屬也容易形成聚集體。SOD1的兩個亞基在基因發(fā)生突變后穩(wěn)定性下降，使SOD1易形成聚合物。同時，不成熟的SOD1由于容易受到氧化損傷而形成聚集物。SOD1不僅位于細胞質中，它還可位于一些膜性細胞器中，SOD1在線粒體膜間和跨高爾基體網絡中可能攜帶更低電荷，由此推斷，凈電荷減低或許可加速SOD1蛋白聚集突變。此外，Tiwari等研究發(fā)現(xiàn)SOD1金屬結合區(qū)域突變體的疏水性明顯增強，疏水性增強使其更容易與其他物質相互作用形成聚集體。

聚集的SOD1可通過影響軸突運輸，線粒體功能，內質網及抑制蛋白酶體功能對疾病產生影響。聚集的異常SOD1可使神經微絲發(fā)生交聯(lián)，使其沉積影響軸突運輸。從而影響神經元功能，在ALS早期即可發(fā)現(xiàn)有軸突逆向運輸?shù)膿p害。異常SOD1還可抑制蛋白酶體的功能，引起神經元變性死亡，此外還可影響線粒體功能，引起鈣離子超載，使線粒體ATP產生障礙，產生氧化損傷及引起細胞凋亡。

2 谷氨酸(Glu)毒性作用

Glu與N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)結合后使鈣離子內流，激活一系列蛋白酶和蛋白激酶，使蛋白質的分解和自由基生成增加，脂質過氧化過程加強，神經元自行溶解。有學者發(fā)現(xiàn)ALS病人血漿中Glu濃度升高，腦脊液中Glu及天冬氨酸的比值增高。當Glu的清除發(fā)生障礙時，會造成神經元細胞的毒性。

有學者將含有較高濃度Glu的ALS病人血清加入正常培養(yǎng)的脊髓前角運動神經元中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)數(shù)小時后神經元明顯受損。還有人將此血清加入到ALS脊髓培養(yǎng)模型中發(fā)現(xiàn)運動神經元較正常對照組減少。

在ALS病人腦脊液和大腦皮層中發(fā)現(xiàn)有DNA氧化損傷標記物8-羥基2-脫氧鳥苷酸濃度升高和脂質過氧化產物丙二醇含量的增多。過量的Glu可激活非NMDA受體，引起鈣離子內流，細胞可通過鈣結合蛋白緩沖一過性增多的鈣離子，而運動神經元中缺乏鈣結合蛋白，只能通過線粒體緩沖增多的鈣離子，從而使線粒體內的鈣離子超載，鈣離子超載使線粒體功能受損，引起ATP產生障礙，電子傳遞障礙溢出生成自由基，自由基增加觸發(fā)氧化應激，對生物體造成氧化應激損傷，使脂質，蛋白質和DNA、RNA氧化，造成生物膜脂質氧化，破壞生物膜的正常功能，使蛋白質構象變化，影響生物體中酶和相關蛋白的正常功能，使染色體發(fā)生畸變等。同時，Glu轉運體受氧化作用可使其轉運谷氨酸的能力減退，使Glu毒性進一步增加。同時，Glu增多引起鈣離子內流，激活鈣離子依賴性NO合酶(nNOS)，nNOS催化生成具有神經毒性的NO。同時鈣離子超載引起線粒體功能受損，產生氧自由基，NO可與氧自由基作用生成氧化能力更強的ONOO-，它可與體內許多物質反應生成硝基化產物，產生神經元毒性。

3 線粒體功能障礙

線粒體是產生ATP的最基本單位，他可維持鈣離子穩(wěn)態(tài)，參與鈣離子信號傳遞，還能調節(jié)內在細胞凋亡。在ALS案例中很早就發(fā)現(xiàn)有線粒體形態(tài)學宏觀和微觀的改變，如神經元中可有線粒體的聚集和增大，并且后來還發(fā)現(xiàn)有功能上的改變，如在SOD1突變小鼠的線粒體呼吸鏈復合體I和IV活性均有下降。有報道稱:在一個運動神經元病人中觀察到有細胞色素C氧化酶單位I的缺失。在另外一個病人中則發(fā)現(xiàn)有線粒體tRNA的基因突變。除此以外，在散發(fā)性ALS病人腰背的脊髓前角和近端軸突中可發(fā)現(xiàn)線粒體的大量聚集。目前有報道在突變SOD1轉基因小鼠中可見異常的線粒體聚集〔4〕。

線粒體可緩沖興奮性細胞內的鈣離子潮，在運動神經元等易興奮細胞中起著重要的緩沖一過性鈣離子增多的作用。在細胞和動物ALS模型中均發(fā)現(xiàn)有鈣離子濃度的增加和線粒體的破壞。在出現(xiàn)臨床癥狀前的G93A突變轉基因小鼠大腦和脊髓中發(fā)現(xiàn)有線粒體承載鈣離子能力的下降。另外，鈣離子可激活產生反應性氧簇(ROS)的酶產生，從而使膜滲透性改變進一步加劇鈣離子的流入〔5〕。細胞內增加的鈣離子又可擴大Glu介導的毒性作用，同時又可進一步引起鈣離子的細胞內流〔6〕。

早期的研究認為，線粒體介導的凋亡參與了運動神經元的退變。但相關的研究并未取得實質性的成果。有研究表明，神經肌肉失神經改變遠在在凋亡蛋白激活前便已出現(xiàn)。在出現(xiàn)神經肌肉失神經表現(xiàn)后，在神經肌肉接頭處運動神經元內出現(xiàn)線粒體畸形，而且，在軸突尚未從神經肌肉接頭處撤離時，在運動神經元的突觸末端聚集有大量的突變SOD1。由這些研究推斷，線粒體的改變或許在失神經改變中起著重要的作用。目前轉基因小鼠實驗傾向于“死亡撤退”假說，即運動神經元的死亡是末端神經軸突破壞而導致的，而非細胞凋亡引起的。目前有力的證據(jù)表明在突變SOD1轉基因小鼠疾病的早期階段，尚未出現(xiàn)臨床癥狀前，可見運動神經元脫離肌肉的失神經表現(xiàn)。轉基因小鼠肌肉中過表達解耦聯(lián)蛋白1，表現(xiàn)為與年齡相關的神經肌肉接頭的退化，終端軸突的退化和逐漸出現(xiàn)的晚期神經元的病理改變〔7〕。這可能是由軸突運輸系統(tǒng)受損引起的，在神經退行性病變中均發(fā)現(xiàn)有線粒體運輸?shù)膿p害，線粒體運輸障礙會導致線粒體形態(tài)的改變，使線粒體在軸突和神經末梢的分布減少，減少ATP的產生，降低緩沖鈣離子的能力。而且還會引起線粒體動力學障礙。這個結果進一步支持神經肌肉接頭末梢的病理改變會導致ALS中運動神經元的退行性病變。并且進一步提示線粒體在其中所起的重要作用。而ALS中的SOD1會干擾線粒體的功能，因此，維持軸突末梢一定數(shù)量的正常功能的線粒體或許可為ALS的治療提供一絲希望。

4 星形膠質細胞作用

正常的星型膠質細胞的功能可參與神經遞質傳遞代謝，它通過攝取突觸間隙中的Glu和γ-氨基丁酸(GABA)用來合成神經元中的遞質谷氨酰胺和GABA，減少突觸間隙中的Glu濃度，進而減少Glu所引起來的興奮性毒性。

在動物模型中發(fā)現(xiàn)，神經毒性需要非神經元細胞中也要有突變人SOD1(hSOD1)的表達，實驗表明，轉基因小鼠中單純的在神經元細胞或膠質細胞中表達突變的hSOD1不能引起運動神經元病的發(fā)生。在高級脊椎動物的中樞神經系統(tǒng)中，星型膠質細胞通過一種叫做膠質化反應的形式來應對各種損傷，如創(chuàng)傷，感染，局部缺血和神經變性過程〔8，9〕。在 ALS病人中，可觀察到在上下運動神經元周圍均有膠質化反應。

星型膠質細胞在ALS病人中可能的損傷機制包括:(1)下調星型膠質細胞Glu轉運體:很多ALS病人腦脊液中有Glu的增加和在皮質區(qū)和脊髓中Glu轉運體(EAAT2)表達的減少。興奮性氨基酸通過突觸前膜和星型膠質細胞上的Glu轉運體而清除，在ALS病人中，EAAT2轉運體受損或者缺失與星型膠質細胞增生同時出現(xiàn)。這些表明，Glu轉運體的丟失是繼發(fā)于膠質化反應的。膠質細胞還可通過主動釋放Glu鹽而引起神經元興奮性毒性損傷，膠質細胞中的炎性改變可激發(fā)Glu鹽的釋放，因此可加劇神經元的興奮性毒性。星型膠質細胞還有可能通過另外一種機制來影響神經元對興奮性毒性的敏感性，鈣離子滲透通過的抗毒覃堿樣抗帕金森病藥 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMAP)受體通過一種AMAP受體第二亞單位(GluR2)單位調控，GluR2可產生受體不利于鈣離子的滲透，星型膠質細胞可上調共同培養(yǎng)的運動神經元細胞上的GluR2的表達從而起到保護神經元細胞免受興奮性毒性損害的作用，然而，若是在星形細胞中表達突變的hSOD1，則會下調GluR2，從而造成神經元細胞的損害。(2)NO:在ALS病人和ALS動物模型中，反應性星型膠質細胞可上調iNOS的表達和造成氧化應激及硝化應激。在體外，星型膠質細胞和運動神經元細胞表現(xiàn)為對NO和過氧化硝酸鹽不同的敏感性，在神經元細胞中，它們可引起線粒體功能的障礙和細胞的死亡，星型膠質細胞卻不受影響。在用細胞因子處理過的星形膠質細胞可產生NO使一起培養(yǎng)的皮質運動神經元的線粒體呼吸鏈受損，以及加強NMDA介導的興奮性毒性。抑制iNOS可以阻止運動神經元丟失。(3)死亡受體腫瘤壞死因子α(TNF-α)，神經營養(yǎng)因子受體(p75NTR)及Fas/CD95，在hSOD1 G93A小鼠臨床癥狀出現(xiàn)前可在它的腰背脊髓中觀察到TNF-α及它的促凋亡受體TNF-R1 mRNA的升高，而膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中TNF-α的主要來源。除此以外，在ALS病人血清中，可觀察到TNF-α和可溶的TNF受體的增加。脊髓運動神經元在胚胎期會正常的表達p75NTR引起細胞的死亡，但是他的表達會在出生后停止，p75NTR及TrkA均不在成人的運動神經元中表達，但p75NTR會在軸突損傷及ALS中再次出現(xiàn)表達，在ALS小鼠模型中，退變的運動神經元重新表達p75NTR，其周圍的反應性星型膠質細胞則表達神經生長因子(NGF)，NGF在酪氨酸激酶受體(TrkA)缺失的情況下可與p75NTR結合，并可引起細胞的死亡。Fas和Fas配體(FasL)一樣在胚胎期的運動神經元中正常表達導致細胞的死亡，然而，F(xiàn)as信號傳導在軸突損傷導致的神經元細胞死亡中出現(xiàn)，提示這種路徑可能會在神經元細胞變性的病理過程中激活。從突變hSOD1小鼠胚胎中分離出的運動神經元表現(xiàn)為對Fas激活和NO敏感性的增加。這表明由星形膠質細胞產生的Fas和NO激活物可能會引起或促進運動神經元的死亡。

5 免疫和炎性反應

在ALS中有明顯的炎性表現(xiàn)〔10〕。ALS病人尸檢中發(fā)現(xiàn)有免疫異常表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有小膠質細胞激活形態(tài)學的改變和細胞表面受體的表達。在出現(xiàn)臨床癥狀的SOD1突變動物中，出現(xiàn)了明顯的炎性反應。早期發(fā)病與星形膠質細胞相關，晚期則與小膠質細胞相關〔11〕，且小膠質細胞在疾病早期就已發(fā)揮作用〔12〕。

實驗通過對抗體、T細胞、趨化因子、細胞因子和其他炎性標志物的研究表明ALS中出現(xiàn)有異常的炎性反應，ALS中存在鈣離子電壓依賴性通道抗體，IgG水平的升高〔13〕。ALS病人血液中有CD4+輔助細胞的增加和單核細胞及巨噬細胞中人類白細胞抗原(HLA)Ⅱ類分子的表達增加，有白細胞介素(IL)-13，它可產生T細胞并且和疾病的進展相關。在ALS血清中發(fā)現(xiàn)有IL17、IL-6的升高。ALS病人腦脊液中克隆出來的T細胞可被誘導產生干擾素。在ALS中亦有循環(huán)的趨化因子和組織因子的增加，脂多糖水平、C3的升高〔14〕。此外，其他炎性因子也可出現(xiàn)異常。

ALS中出現(xiàn)的炎癥反應是有益還是有害的還未知。在SOD1小鼠臨床癥狀出現(xiàn)前，通過給予可抑制小膠質細胞激活的二甲胺四環(huán)素處理可延緩疾病的進展〔15〕。SOD1小鼠中的炎性反應由炎性介質介導，通過類似無菌性炎癥樣受體激活導致無菌性炎癥。無菌性炎癥可激活細胞凋亡蛋白酶1，進一步激活IL-1β。缺乏細胞凋亡蛋白酶1或者IL-1β或者通過IL-1受體拮抗劑處理過的SOD1小鼠表現(xiàn)壽命的延長〔16〕。這些研究均表明此類炎癥反應在SOD1小鼠中會加重疾病。同樣有證據(jù)表明保護性免疫機制可減輕疾病。炎性反應的保護作用包括小膠質細胞清除碎片和與T細胞交聯(lián)。大腦特殊的T細胞可能通過釋放的細胞因子和生長因子在損傷部位發(fā)揮修復損傷炎性組織的作用。這種保護性的免疫反應作為一種自我平衡調節(jié)很普遍的存在。保護性機制可使神經系統(tǒng)減輕受到的破壞，保護性免疫機制由調節(jié)性T細胞介導，轉導正常調節(jié)性T細胞(Treg)的G93A SOD1小鼠可延遲發(fā)病時間〔17〕。缺乏T細胞的小鼠則表現(xiàn)為胰島素樣生長因子(IGF-1)的缺乏和IL-6的下調及促炎性趨化因子和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶2(NOX2)的增加。

6 TDP-43和FUS

2006年在ALS病人的運動神經元和膠質細胞中發(fā)現(xiàn)有TDP-43(TAR DNA binding protein-43)包涵體。并且進一步認為TDP-43為ALS的致病蛋白。TDP-43是由位于1號染色體上由TAR DBP基因編碼的核蛋白，它由414個氨基酸組成，有2個RNA識別模體和一個C端甘氨酸富集區(qū)，C端可與單股DNA和RNA及蛋白相結合。最初對TDP-43的認識是它作為轉錄抑制物結合于人類免疫缺陷病毒(HIV-I)病毒的TARDNA上。后來發(fā)現(xiàn)它亦可參與調節(jié)轉錄、剪接、細胞凋亡、細胞分裂，mRNA的穩(wěn)定等。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，TDP-43為動物生存的必需基因，完全缺失此基因的胚胎不能存活，部分缺失則出現(xiàn)產后死亡〔18〕。正常的TDP-43定位于神經元和膠質細胞的核內，它在神經系統(tǒng)中的作用目前還是未知，現(xiàn)有研究表明他可能作為神經興奮反應因子參與神經元的重塑〔19〕。

TARDBP基因目前已發(fā)現(xiàn)有30多種突變，大部分位于甘氨酸富集區(qū)，但突變基因檢出頻率低。目前對于TARDBP突變或者TDP-43在神經退行性疾病中所起的病理作用還知之甚少，在ALS和FTD病人受損神經元中TDP-43的錯誤定位，表明TDP-43正常功能的喪失可能與疾病發(fā)病機制有關。有研究表明，缺乏TDP-43的人類細胞可導致細胞核形態(tài)的改變和引起凋亡發(fā)生〔20〕。從另一方面看，細胞內的TDP-43包涵體可能使細胞獲得毒性。在酵母菌中過表達TDP-43表明只有聚集形式的TDP-43才有毒性〔21〕。此外，影響TDP-43在細胞質和細胞核之間穿梭的因子可導致其異常聚集和核的錯誤定位〔22〕。

目前研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43的聚集與其錯誤定位和入核通路缺陷有關。核糖核苷酸還原酶大亞基(RRM)缺乏、核定位信號缺失，核轉運體出現(xiàn)異常、蛋白酶體不能有效降解TDP-43均可導致TDP-43的錯定位〔23，24〕。研究表明表達核定位信號損傷的轉基因小鼠出現(xiàn)了TDP-43的胞質錯定位，并且有和額顳葉變性(FTLD)和原發(fā)性側索硬化類似的如神經元喪失等表現(xiàn)。Nishimura等應用siRNA沉默核轉運蛋白和敲除入核因子核質蛋白、細胞凋亡敏感蛋白，結果引起TDP-43的積累〔23〕。此外，TDP-43 C端磷酸化，裂解化、片段化等均可使蛋白聚集形成包涵體〔25〕。

2009年Kwiatkowski等〔26〕在ALS中發(fā)現(xiàn)有Fas基因突變，ALS患者的TDP-43包涵體內存在FUS蛋白，但有些ALS患者有FUS包涵體，無TDP-43包涵體。FUS是與TDP-43功能類似的蛋白，TDP-43，F(xiàn)US是作為獨立的個體各自發(fā)揮作用還是相互共同作用目前還未知，F(xiàn)US蛋白的聚集也與蛋白的錯定位及如何通路缺陷有關。FUS蛋白由于缺乏相關的ALS動物模型，其與疾病的相關機制更是不得而知。

7 小結

ALS運動神經元選擇性損傷的發(fā)病機制目前尚未明確，雖然目前發(fā)現(xiàn)ALS發(fā)病可能與SOD1突變等相關，但這些異常是疾病的發(fā)病機制還是繼發(fā)于疾病出現(xiàn)的及相互之間的關系，目前仍不是非常清楚，對ALS發(fā)病機制的了解對ALS的治療有很大幫助，目前，作為Glu拮抗劑的利魯唑是唯一治療ALS有效的藥物。近幾年發(fā)現(xiàn)的TDP-43和FUS蛋白使ALS的研究邁進了一大步，對這兩種蛋白的深入研究或許可為ALS的治療提供有效的策略。

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