王 丹 (遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

惡性膠質(zhì)瘤是老年患者中最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤〔1〕，其感染部位特殊且極具侵襲性，通過(guò)手術(shù)或放/化療均不能取得理想的效果，因此復(fù)發(fā)率高、生存期短〔2〕。新生血管是腫瘤增殖的基礎(chǔ)，也是侵襲和轉(zhuǎn)移的根基，同時(shí)膠質(zhì)瘤也是血管化程度最高的腫瘤之一，因此靶向抑制膠質(zhì)腫瘤血管生成是目前研究的熱點(diǎn)〔3〕。Endoglin蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生成過(guò)程中特異性高表達(dá)，因此成為了一個(gè)很有前景的生物靶分子〔4〕。本文通過(guò)干擾Endoglin的表達(dá)，研究其對(duì)膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響，為開(kāi)拓膠質(zhì)瘤血管治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 新鮮的惡性膠質(zhì)瘤組織取自我校附屬醫(yī)院外科手術(shù)切除的標(biāo)本，在手術(shù)室無(wú)菌環(huán)境下取材后放入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡并送到細(xì)胞室，分離內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)準(zhǔn)備。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2-MV)BulletKit試劑購(gòu)自Lonza公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，胰蛋白酶、谷氨酰胺、二甲基亞砜、焦炭酸二乙酯購(gòu)自Sigma公司，RNAiso Reagent、RT-PCR試劑盒、DNA Marker購(gòu)自 TaKaRa公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。常用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑及溶液均為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將分離出來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞置于EGM-2-MV培養(yǎng)基中適宜條件培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%時(shí)從恒溫培養(yǎng)箱中取出吸去培養(yǎng)液，加入PBS震蕩后棄去，加入胰蛋白酶消化液，在鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞皺縮并且逐漸變圓時(shí)加入終止液停止消化，將培養(yǎng)基注入離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清加PBS重新1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將傳代細(xì)胞置于各個(gè)新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法 將上述傳代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度稀釋至2×104/ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)孔在開(kāi)始試驗(yàn)前2 h內(nèi)加入10μl的膽囊收容素八肽(CCK-8)溶液，之后每孔加入100μl細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度，連續(xù)測(cè)量1 w做出生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染及檢測(cè)方法 將含有綠色熒光蛋白(GFP)熒光標(biāo)記基因的Endoglin-shRNA慢病毒液進(jìn)行擴(kuò)增，將空病毒載體作為對(duì)照液，選擇生長(zhǎng)情況良好的傳代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)共分為三組:沉默組(加Endoglin-shRNA)、對(duì)照組(加對(duì)照液)、空白組(未進(jìn)行病毒感染)，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察，估計(jì)慢性病毒感染效率并計(jì)算Endoglin基因的沉默率，將三組細(xì)胞進(jìn)行消化成單細(xì)胞，利用PBS洗滌和重懸后再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。

1.2.4 總RNA鑒定 將細(xì)胞的胞內(nèi)總RNA按常規(guī)方法提取后用超純水將RNA稀釋50倍，用紫外分光光度法測(cè)量260 nm和280 nm處的OD值，測(cè)量結(jié)果×50則為RNA實(shí)際濃度，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性鑒別。

1.2.5 qPCR 將分離出的RNA混入實(shí)時(shí)PCR管內(nèi)，按照95℃ 5 min→(95℃ 30 s→65℃ 30 s→75℃ 30 s→90℃ 30 s)×40次→65℃ 10 min循環(huán)1次，將擴(kuò)增產(chǎn)物加入內(nèi)切酶酵解。

1.2.6 Western印跡 將細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞總蛋白，以標(biāo)準(zhǔn)FBS為對(duì)照測(cè)量蛋白質(zhì)含量，按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳方式在95 V下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后在50 V下轉(zhuǎn)膜1 h，轉(zhuǎn)移成功后用超純水洗去脫色液，將蛋白膜用Tris鹽酸緩沖液(TBS)浸潤(rùn)后封閉振搖1 h，將一抗用TBST稀釋后浸潤(rùn)于膜蛋白上，過(guò)夜孵育，將二抗與蛋白膜接觸常溫孵育1 h，再用TBST振搖清洗兩次，TBS清洗1次，將化學(xué)發(fā)光液均勻涂于蛋白膜上進(jìn)行圖像采集分析。

1.2.7 劃痕試驗(yàn) 將細(xì)胞置于24孔板內(nèi)，平鋪細(xì)胞至完全融合，用小槍頭從中間劃一刀線，換液時(shí)去除擦下的細(xì)胞，使用活細(xì)胞工作站連續(xù)觀察細(xì)胞遷移過(guò)程，每隔20 min進(jìn)行一次圖像采集，連續(xù)采集30 h。

1.2.8 Matrigel小管形成 在冰浴環(huán)境下溶解Matrigel，按每孔30μl加入96孔板內(nèi)，于37℃孵育30 min，稀釋細(xì)胞懸液為5×104/ml后每個(gè)孔內(nèi)加入100μl，置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)72 h后鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)特征 培養(yǎng)基中的惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞呈不規(guī)則梭形或多邊形，卵圓細(xì)胞貼壁，細(xì)胞內(nèi)含有豐富的胞漿，在梭形細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)多個(gè)核仁，相鄰細(xì)胞膜有融合現(xiàn)象。

2.2 惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)皮細(xì)胞慢性病毒干擾率檢測(cè)結(jié)果 倒置熒光顯微鏡聯(lián)合流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默組感染率達(dá)到93%，感染效果理想。將三組進(jìn)行qPCR擴(kuò)增檢測(cè)顯示沉默組Endoglin mRNA表達(dá)較對(duì)照組和空白組明顯下調(diào)，通過(guò)Western印跡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)沉默組Endoglin蛋白下調(diào)明顯，提示慢病毒轉(zhuǎn)染后沉默效果理想。

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)刺激反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果 三組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)下增殖無(wú)明顯變化，但用外源性VEGF刺激后沉默組增殖率明顯低于其余兩組，且沉默組的VEGF受體(VEGFR2)表達(dá)未增加，另外兩組VEGFR2表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，由此提示Endoglin基因可能會(huì)直接影響VEGFR2的表達(dá)。

2.4 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 沉默組細(xì)胞與對(duì)照組比較細(xì)胞遷移速度明顯變慢，遷移數(shù)量也明顯減少(P＜0.05)，提示Endoglin蛋白可能會(huì)直接影響細(xì)胞遷移情況。

2.5 Matrigel小管試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組在Matrigel培養(yǎng)中互相連接形成明顯的條索狀，最終形成了初步的小管樣結(jié)構(gòu)，沉默組內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的能力明顯減弱，在鏡下觀察僅形成初級(jí)條索狀未能形成成形的小管結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組比較有極顯著差異(P＜0.01)，提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接聯(lián)系。

2.6 苯質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)、MMP2、趨化因子苯質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體(CXCR4)變化檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默組和對(duì)照組在MMP9、CXCR4表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但沉默組MMP2的表達(dá)明顯消弱，和對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，同樣提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接聯(lián)系。

3 討論

Endoglin蛋白是180 kD同型二聚體細(xì)胞膜糖蛋白，其編碼基因Endoglin位于人染色體9q34內(nèi)，共含有633個(gè)氨基酸。Endoglin蛋白有L/S兩種異構(gòu)體，其主要區(qū)別在于氨基酸組成方式不同〔5〕。Endoglin蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)受體復(fù)合物的一個(gè)輔助成分，在體內(nèi)主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移等與細(xì)胞形成相關(guān)的過(guò)程，在內(nèi)皮細(xì)胞上的表現(xiàn)多體現(xiàn)在激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Endoglin蛋白對(duì)血管發(fā)育有極其重要的作用，曾有研究人員敲除小鼠Endoglin基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在受孕15 d內(nèi)均死于心血管發(fā)育缺陷〔6〕。另有研究〔7〕指出在人胚胎期4～8 w時(shí)，Endoglin基因高表達(dá)造成Endoglin蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞上含量較多，而人胚胎期4～8 w內(nèi)為心血管快速發(fā)育時(shí)期。本研究結(jié)果提示Endoglin基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖作用有顯著調(diào)節(jié)性，通過(guò)MMP2含量下降也可以印證上述觀點(diǎn);另外，Endoglin基因在血管形成方面起著極其重要作用，且能夠通過(guò)影響血管生成進(jìn)而影響細(xì)胞遷移。

通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)Endoglin蛋白是抗擊惡性膠質(zhì)瘤的理想靶點(diǎn)，其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響比目前治療方案更為直接且聯(lián)系更為緊密，為后續(xù)研究奠定了分子基礎(chǔ)。

1 張艷春，齊 玲，嚴(yán) 海，等.TRAIL與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)LN215細(xì)胞凋亡的作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(18):3943-4.

2 沈維高，王躍華，繆春明，等.羥基磷灰石納米粒子運(yùn)載Stat3 shRNA對(duì)鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的促凋亡效應(yīng)〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012;13(1):53-7.

3 Gougos A，Letarte M.Identification of a human endothelial cell antigen with monoclonal antibody 44G4 produced against a pre-B leukemic cell line〔J〕.Immunology，1998;121(6):1925-33.

4 Sachdeva G，D'Costa J，Cho JE，et al.Chimeric HIV-1 and HIV-2 lentiviral vectors with added safety insurance〔J〕.JMed Virol，2007;79(2):118-26.

5 Perez-Gomez E，Eleno N，Lopez-Novoa JM，et al.Characterization of murine S-endoglin isoform and its effects on tumor development〔J〕.Oncogene，2005;24(27):4450-61.

6 Arthur HM，Ure J，Smith AJ，et al.Endoglin，an ancillary TGFbeta receptor，is required for extraembryonic angiogenesis and plays a key role in heart development〔J〕.Devel Biol，2009;217(1):42-53.

7 Qu R，Silver MM，Letarte M.Distribution of endoglin in early human development reveals high levels on endocardial cushion tissue mesenchyme during valve formation〔J〕.Cell Tiss Res，1998;292(2):333-43.