林群英，吳亮亮，張鋒倫，孫曉明

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京210042)

蟲(chóng)草(Cordyceps)液體培養(yǎng)最早可追溯到1951年，僅比深層發(fā)酵應(yīng)用于大型食用真菌晚4 年［1］。液體發(fā)酵具有快速、高效且簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)蟲(chóng)草的一種重要途徑，同時(shí)，也是蟲(chóng)草子實(shí)體栽培最常用的生產(chǎn)菌種制作方式。目前，不少蟲(chóng)草如蛹蟲(chóng)草(C. militaris)和古尼蟲(chóng)草(C. gunnii)等已經(jīng)成功進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，蛹蟲(chóng)草已達(dá)噸級(jí)生產(chǎn)規(guī)模［2］。一些新發(fā)現(xiàn)或生長(zhǎng)要求嚴(yán)格的蟲(chóng)草種類還處于試驗(yàn)階段，如冬蟲(chóng)夏草(C. sinensis)、江西蟲(chóng)草(C. jiangxiensi)和粉被蟲(chóng)草(C. pruinosa)。發(fā)酵產(chǎn)物主要有菌絲體和多糖、蟲(chóng)草素、腺苷和蟲(chóng)草酸等活性物質(zhì)。以下主要對(duì)影響蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)因素和環(huán)境條件兩方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的影響

1.1 碳源

蟲(chóng)草多以結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的單糖和雙糖為生長(zhǎng)的最佳碳源。蛹蟲(chóng)草菌絲體在含有葡萄糖或蔗糖的培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)最好［3-4］。而陳晉安等人認(rèn)為蛹蟲(chóng)草的菌絲生長(zhǎng)以蔗糖為最佳碳源，效果遠(yuǎn)優(yōu)于葡萄糖［5］。亦有研究顯示甘露醇、淀粉和半乳糖最利于蛹蟲(chóng)草菌絲體的生長(zhǎng)［6-7］。這可能是由于菌株或其他營(yíng)養(yǎng)因素的差異而引起的。而蛹蟲(chóng)草胞外多糖形成的最佳碳源為蔗糖［7］。除菌絲體和胞外多糖外，蛹蟲(chóng)草還可利用馬鈴薯淀粉產(chǎn)生最大量的過(guò)氧化物酶［8］，能利用葡萄糖產(chǎn)生最大量的蟲(chóng)草素，產(chǎn)量與葡萄糖的用量無(wú)相關(guān)性［9］。誘變育種可改變菌株對(duì)碳源的要求。經(jīng)離子束誘變育種獲得的菌株G81 -3 所需的葡萄糖濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株，蟲(chóng)草素的濃度可達(dá)6.84 g/L，遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株［10］，同時(shí)，葡萄糖是蛹蟲(chóng)草液體菌種生產(chǎn)的最佳碳源好［11］。

其它蟲(chóng)草對(duì)碳源的利用情況與蛹蟲(chóng)草相似，以單糖或雙糖為生長(zhǎng)的最佳碳源，但在碳源的種類方面表現(xiàn)出各自的營(yíng)養(yǎng)差異。單側(cè)蟲(chóng)草(C. unilateralis)菌絲生長(zhǎng)以葡萄糖為最佳，但幾乎完全無(wú)法利用蔗糖［12］。冬蟲(chóng)夏草、江西蟲(chóng)草和大團(tuán)囊蟲(chóng)草(C.ophioglossoides)L2 菌絲生長(zhǎng)以蔗糖為最佳［13-15］，辛克萊擬青霉(P. sinclairii)、辛克萊蟲(chóng)草(C. sinclairii)無(wú)性型)以蔗糖為菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖形成的最佳碳源［16］。蜂頭蟲(chóng)草(C. sphecocephalla)和細(xì)腳擬青霉(P. tenuipes，高雄山蟲(chóng)草(C. takaomontana)無(wú)性型)C240 分別利用蔗糖和葡萄糖形成的胞外多糖得率最高［16-17］。蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)或次生代謝物形成的最佳碳源還有麥芽糖、甘露糖、馬鈴薯淀粉和甘露醇等［18-21］。

不同種類或同一種類不同菌株的蟲(chóng)草對(duì)碳源表現(xiàn)出一定的差異，因而在進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)前必須先進(jìn)行碳源篩選以獲得最佳的培養(yǎng)效果。

1.2 氮源

氮源是影響蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的另一重要營(yíng)養(yǎng)成分，甚至可起到碳源的作用。氮源可分為有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮，有機(jī)氮包括動(dòng)物性氮源、植物性氮源和微生物氮源。多數(shù)情況下，有氮源比無(wú)機(jī)氮更利于蟲(chóng)草的培養(yǎng)。

與碳源的利用情況相似，蛹蟲(chóng)草的不同菌株對(duì)氮源表現(xiàn)出較大的差異。有報(bào)道認(rèn)為酵母浸膏比蛋白胨更利于蛹蟲(chóng)草菌絲的生長(zhǎng)［5-6，22］。Wang 等人(2006)則認(rèn)為蛹蟲(chóng)草對(duì)酵母浸膏和胰蛋白胨的利用情況無(wú)差別，均可達(dá)到最大生物量。玉米粉是蛹蟲(chóng)草菌株NG1、NG3 菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖形成的最佳氮源［4，23］;玉米粉和蛋白胨分別是菌株C738 菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖形成的最佳氮源［24］。蛋白胨亦是制作蛹蟲(chóng)草液體菌種最佳的氮源［25］。蛹蟲(chóng)草對(duì)氮源的用量有一定的要求，當(dāng)酵母浸膏的用量超過(guò)最佳值后，用量越大，蛹蟲(chóng)草菌絲體的產(chǎn)量反而越低［26］。以上所有研究均顯示，有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更利于蛹蟲(chóng)草菌絲的生長(zhǎng)和胞外多糖的形成。

其它蟲(chóng)草種類對(duì)氮源的利用情況與蛹蟲(chóng)草相似，多能利用蛋白胨和酵母浸膏。細(xì)腳擬青霉C240的菌絲生長(zhǎng)以胰蛋白胨為最佳氮源［18］。冬蟲(chóng)夏草和蜂頭蟲(chóng)草的菌絲利用蛋白胨生長(zhǎng)最快，蜂頭蟲(chóng)草利用酵母浸膏形成的胞外多糖產(chǎn)量最高［13，17］。江西蟲(chóng)草利用酵母浸膏達(dá)最大生物量和多糖產(chǎn)量［14］，單側(cè)蟲(chóng)草亦如此，而幾乎無(wú)法利用蛋白胨、酪蛋白和乳白蛋白［12，19］。大團(tuán)囊蟲(chóng)草利用經(jīng)水解的蠶蛹和酵母浸膏作為最佳的菌絲生長(zhǎng)氮源［15］。粉被蟲(chóng)草利用牛肉浸膏使菌絲生長(zhǎng)最快［27］。在靜置培養(yǎng)時(shí)，古尼蟲(chóng)草利用尿素生長(zhǎng)最快［20］。辛克萊擬青霉利用玉米粉作為氮源能達(dá)最大菌絲生長(zhǎng)速度和多糖產(chǎn)量［16］。

部分種類能利用無(wú)機(jī)氮進(jìn)行生長(zhǎng)，單側(cè)蟲(chóng)草以硫酸銨為唯一氮源時(shí)，能產(chǎn)生最大量的具抗瘧疾活性的萘醌類物質(zhì);細(xì)腳擬青霉以硝酸鉀為多糖形成的最佳氮源［18］。蛹蟲(chóng)草利用硝酸鹽和銨鹽僅能產(chǎn)生不足5.5 g/L 的菌絲體和0.57 g/L 胞外多糖，以氯化銨為氮源時(shí)，僅能生成1.75 g/L 菌絲體［4，7］。多數(shù)情況下，與有機(jī)氮培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)量(15 g/L ～20 g/L)相比，無(wú)機(jī)氮極不利于蟲(chóng)草菌絲培養(yǎng)。

1.3 碳氮比

碳氮比是指培養(yǎng)基中碳元素總分子量與氮元素總分子量的比值。實(shí)際應(yīng)用中，有不少研究是按質(zhì)量計(jì)算碳氮比的。合適的碳氮比(10∶1 ～20∶1，分子量比)可促使蟲(chóng)草菌絲的生長(zhǎng)，最大限度地提高培養(yǎng)基原料的利用率。冬蟲(chóng)夏草菌絲在碳氮比為12∶1(分子量比)時(shí)生長(zhǎng)最好［13］。碳氮比為20∶1和12∶1(分子量比)，辛克萊擬青霉菌絲體和多糖的產(chǎn)量最高，分別為30 g/L 和2.9 g/L［16］。碳氮比為20∶1(分子量比)時(shí)，蛹蟲(chóng)草菌絲體產(chǎn)量最高，達(dá)27 g/L，多糖為6.99 g/L，過(guò)低的碳氮比會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌絲得率下降。碳氮比為2∶1(質(zhì)量比)時(shí)，蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)的蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高，可達(dá)345.4 mg/g［7，9］，菌絲生長(zhǎng)最快［28］。

1.4 其他營(yíng)養(yǎng)成分

除碳源和氮源外，無(wú)機(jī)鹽和維生素也是蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基的重要組成部分。無(wú)機(jī)鹽包括大量元素和微量元素，這些元素能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，或能提高胞外多糖等有效成分的產(chǎn)量。由于培養(yǎng)基中使用的碳源和氮源，尤其是氮源多為抽提物，含有較多其他物質(zhì)，其中亦包括無(wú)機(jī)鹽，所以，已有的研究結(jié)果只在一定程度上說(shuō)明其生理作用。盡管如此，無(wú)機(jī)鹽的研究仍是發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的重要內(nèi)容。鈣、鎂、鉀和鈉等大量元素對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯的作用，微量元素銅、鐵、錳和鋅有一定的促進(jìn)作用［13］。K2HPO4和KH2PO4分別對(duì)細(xì)腳擬青霉的菌絲生長(zhǎng)和多糖形成有促進(jìn)作用［18］。FeSO4和KH2PO4對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)有輕微的抑制作用［4］，但FeSO4對(duì)蟲(chóng)草素有顯著的促進(jìn)作用［29］。Ca2+，Co2+，F(xiàn)e2+，K+和Mn2+對(duì)辛克萊擬青霉有促進(jìn)作用［16］。

酵母浸膏不僅作為氮源，還是重要的維生素來(lái)源，基本可以滿足蟲(chóng)草生長(zhǎng)的要求，然而，維生素對(duì)蟲(chóng)草生長(zhǎng)影響的系統(tǒng)研究報(bào)道卻十分少見(jiàn)。董彩虹和姚一建詳細(xì)研究了維生素對(duì)冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)僅葉酸有明顯的促進(jìn)作用［13］。

除以上各種常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)元素外，一些獨(dú)特的物質(zhì)對(duì)蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響也有報(bào)道。植物油和真菌激發(fā)子分別對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲的生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素的產(chǎn)量有刺激作用［26，30］。

2 環(huán)境條件對(duì)蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的影響

2.1 溫度

大多數(shù)情況下，培養(yǎng)溫度為20 ℃～25 ℃時(shí)蟲(chóng)草的菌絲生長(zhǎng)最快，在稍高溫度(25 ℃～30 ℃)下產(chǎn)生較多的胞外多糖。蛹蟲(chóng)草菌株的最適生長(zhǎng)溫度范圍在20 ℃～25 ℃，最適值因不同菌株而有所不同;在25 ℃～30 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)雖受到一定抑制，但胞外多糖的產(chǎn)量卻得到很大的提高［4-5，23，31］。與蛹蟲(chóng)草相似，江西蟲(chóng)草和辛克萊擬青霉在25 ℃下達(dá)最高生物量，而在28 ℃和30 ℃下，分別生產(chǎn)出最高產(chǎn)量的多糖［14，16］。25 ℃下，古尼蟲(chóng)草、分離自泰國(guó)的單側(cè)蟲(chóng)草和分離自韓國(guó)的蜂頭蟲(chóng)草達(dá)最快生長(zhǎng)速度［17，32-33］。細(xì)腳擬青霉C240 的生長(zhǎng)溫度比一般種類高，28 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最快，胞外多糖產(chǎn)量最高［18］。冬蟲(chóng)夏草最為特別，最佳生長(zhǎng)溫度范圍為18 ℃～20 ℃，且對(duì)溫度的改變極為敏感，25 ℃以上則嚴(yán)重抑制生長(zhǎng)，是一種少見(jiàn)的嗜低溫蟲(chóng)草種類。目前，還未發(fā)現(xiàn)最適生長(zhǎng)溫度高于30 ℃的蟲(chóng)草種類或菌株。

2.2 pH 值

pH 值是對(duì)菌絲生理、生長(zhǎng)有重要作用的因素。酸性至中性的溫和條件適合蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)，而胞外多糖的形成則以中性至弱堿性為好，或略高于菌絲生長(zhǎng)的最佳pH。

弱酸性至中性范圍(pH 6.0 ～pH 7.0)是古尼蟲(chóng)草、細(xì)腳擬青霉、辛克萊擬青霉、蟬擬青霉C240、巴西蟲(chóng)草(C. brasiliensis)等菌絲生長(zhǎng)和胞外多糖形成的最佳pH 條件［16，18，33-34］。Xu 等人再次對(duì)細(xì)腳擬青霉C240 菌株進(jìn)行研究后，認(rèn)為pH 4.88 和pH 4.00 是菌絲生長(zhǎng)和多糖形成的最佳pH，但文中并未對(duì)這與2003 年報(bào)道的明顯不同的結(jié)果進(jìn)行比較或分析原因［35］。有些種類選擇更酸的生長(zhǎng)環(huán)境，如蜂頭蟲(chóng)草在pH 5 和pH 4 下，菌絲生長(zhǎng)最快，形成的多糖最多［17］。蛹蟲(chóng)草的不同菌株對(duì)pH 的要求各有不同，菌株NG3 分別在pH4 和pH8 下，菌株C738分別在pH 9 和pH 6 下，菌絲生長(zhǎng)最快，胞外多糖產(chǎn)量最高［23-24］。有研究則認(rèn)為蛹蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)以酸性至中性(pH 5 ～pH 7)為最佳生長(zhǎng)條件，多糖的生產(chǎn)則以偏堿性的條件為宜［7，36］。日本擬青霉(P.japonica，日本蟲(chóng)草(C. japonica)無(wú)性型)在pH 8 的堿性條件達(dá)最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，菌絲體和胞外多分子聚合體分別為14 g/L 和34.5 g/L［35］。

2.3 通氣狀況

在液體培養(yǎng)時(shí)，蟲(chóng)草需要在一定的通氣條件下才能良好生長(zhǎng)。在以三角瓶振蕩培養(yǎng)時(shí)，振蕩速度一般為120 r/min ～150 r/min。振蕩速度為150 r/min ～200 r/min 時(shí)，粉被蟲(chóng)草和古尼蟲(chóng)草的菌絲體最高產(chǎn)率分別可達(dá)29.97 g/L 和12.18 g/L［27，33］。蜂頭蟲(chóng)草在攪拌速度300 r/min 時(shí)，菌絲體產(chǎn)量最高，達(dá)28.2 g/L;150 r/min 時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)2.5 g/L，與日本擬青霉情況相似［17，37］。蟲(chóng)草素形成的通氣要求要比菌絲生長(zhǎng)低。在經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基內(nèi)，通過(guò)靜置表面培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草，蟲(chóng)草素由原來(lái)的550 mg/L 提高到640 mg/L，最大的生產(chǎn)能力為32 mg/(L·d)［38］。

3 展 望

蟲(chóng)草液體培養(yǎng)研究包括碳源、氮源、碳氮比及其他營(yíng)養(yǎng)成分等營(yíng)養(yǎng)因素和溫度、pH 和通氣等環(huán)境條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)和活性成分產(chǎn)量的影響取得了令人振奮的成果。為更好地利用應(yīng)用蟲(chóng)草液體培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)加強(qiáng)以下兩方面的研究。

3.1 生物合成活性成分

蟲(chóng)草是一類藥用價(jià)值極高的大型真菌，含有豐富多樣的生理活性成分。蟲(chóng)草素是被研究最多的活性物質(zhì)，其產(chǎn)量已經(jīng)通過(guò)誘變育種和優(yōu)化培養(yǎng)條件得到大幅度的提高［39］。而其它活性成分仍有待深入的研究，才能更好地實(shí)現(xiàn)蟲(chóng)草資源的開(kāi)發(fā)利用。結(jié)合新發(fā)展的發(fā)酵技術(shù)如高密度發(fā)酵等，加強(qiáng)蟲(chóng)草資源的開(kāi)發(fā)利用，滿足市場(chǎng)對(duì)蟲(chóng)草產(chǎn)品的需求。

3.2 液體生產(chǎn)種質(zhì)量

蟲(chóng)草液體培養(yǎng)的產(chǎn)量除了直接用于深加工外，作為生產(chǎn)種用于子實(shí)體栽培的系統(tǒng)研究較少報(bào)道。生產(chǎn)種的質(zhì)量可直接影響出草情況，因此，有必要加強(qiáng)在這方面的研究。除了營(yíng)養(yǎng)要求外，其它因素對(duì)液體菌種質(zhì)量的影響仍有待進(jìn)一步研究。

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