王長寶，徐增奇，王 仲，張海軍，楊洪升

平貝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)是百合科多年生草本植物，與川貝母(F.cirrhosa)、浙貝母(F.thunbergii)“三分天下”，為中國藥典收載品種［1］，也是我國東北特產(chǎn)藥材之一［2］。其味苦，性寒。歸肺、心經(jīng)。功效清熱化痰，潤肺止咳，開郁散結。用于治療肺熱咳嗽，久咳痰喘，心胸郁結，煩熱吐血，肺炎、支氣管炎等癥。由于野生平貝母大多在山林蔭蔽條件下，其生長地區(qū)的林木不斷受到砍伐，自然植被遭受破壞，加之不斷采挖和放牧等人為活動影響，野生資源逐漸減少［3］。1984年頒布的中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)將其定為國家三級重點保護植物。本文對平貝母的生物學特性、化學成分、繁殖方法、傳粉生態(tài)學和分子生物學研究進行了綜述，為今后深入研究和應用提供依據(jù)。

1 生物學特性

平貝母植株長可達1 m。鱗莖由2枚鱗片組成，直徑1～1.5 cm;葉輪生或對生;先端不卷曲或稍卷曲?；?～3朵，紫色而具黃色小方格，頂端的花具4～6枚葉狀苞片;雄蕊6枚，花藥近基著，花絲具小乳突;花柱也有乳突;花期5～6月。蒴果倒卵形，具6圓棱、3室、頂裂;內(nèi)含100～150粒種子。種子扁平，半圓形至三角形，黃綠色［4］。平貝母是一種早春植物，喜涼爽濕潤氣候，怕干旱炎熱。早春化凍即萌發(fā)出土，地溫在2～4℃時開始抽莖，13～16℃時進入生長盛期。平貝母生育期極短，(從出苗到枯萎只有60天左右)，生長發(fā)育迅速(春季4月上旬至6月中旬即可完成一個生長發(fā)育過程，秋季8月上旬至10月上旬完成更新芽的分化)，每年在較涼爽的春秋二季生長，在酷熱的夏天和寒冷的冬季休眠［5－6］。平貝母從種子播種到開花結果成株形成，需4～6年時間，其幼苗與成株形態(tài)有顯著不同?？煞譃?線形葉時期、雞舌頭葉時期、四平頭時期、燈籠竿時期［7－8］。平貝母分布地域較廣，東北三省均有零散分布，主要分布于長白山延脈，123°～135°E，40°～48°N范圍內(nèi)濕潤的山腳坡地闊葉林下，山地灌木林帶及林間空地。海拔多在800 m以下。產(chǎn)地氣候寒冷，年平均氣溫2～5℃，1月份平均氣溫－17～－20℃，7月份平均氣溫為20～23℃，溫度年較差為40℃左右;終霜期五月中、下旬，初霜期9月中、下旬，無霜期110～120 d左右;年平均降水量750～1 000 mm，多集中七、八、九3個月。平貝母多生長在上層較厚、質地疏松、結構良好、富含腐殖質的棕色森林土或山地黑鈣土，土壤含水量多在20%～30%左右。

2 化學成分

由于平貝母具有較強的生物活性和較高的應用價值，因此，化學成分方面的研究較多，并探索出許多有效的提取和測定方法，如滴定法、薄層色帶法、分光光度法、高效液相色帶法、氣相色帶法等，從中分離并鑒定出130多種天然化合物，主要為生物堿、生物堿苷及多糖成分［9－14］。

生物堿是平貝母最主要的次生代謝產(chǎn)物，我國學者朱子清從1932年開始研究貝母屬生物堿骨架結構，經(jīng)過20多年的努力工作取得了很大進展，溝通了貝母屬生物堿和藜蘆屬生物堿的關系，確定了貝母生物堿的骨架。1956年，陸仁榮等從平貝母中分得一針狀結晶，與貝母堿混合熔點不降低，從此引起人們才對研究平貝母化學成分重視［15］。1982年，徐東銘等從平貝母中分離和鑒定出6個化合物，即西貝素、貝母辛、平貝堿甲、平貝堿乙、西貝素苷和平貝堿苷［16］。崔東濱等從平貝母莖葉中分得貝母辛、平貝堿甲和貝母甲素、平貝定苷、平貝堿乙、平貝堿丙和平貝寧苷、腺嘌呤核苷、半乳糖醇和琥珀酸等［17］。Kitamura先后從平貝母中分離出6種生物堿:烏蘇里寧、烏蘇里啶、烏蘇里啶酮、烏蘇里酮、平貝酮和平貝堿［18－21］。1996年，陳澤乃等從平貝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分，試驗表明腺苷為抑制血小板聚集的主要成分，并認為核苷類可能是貝母中除生物堿外的另一類重要活性成分［22］。1997年，徐汝明等利用甲醇提取幾種貝母，以層析法粗分離并用紫外分光光法測定其中核苷類化合物的種類和含量。研究結果表明平貝母中含有較高含量的腺苷及低含量的胸苷［23］。2008年，韓成花等從平貝母氯仿－乙酸乙酯提取物種分離并鑒定出棕櫚酸、β－谷甾醇和曼陀羅3種單體化合物［24］。2011年，劉春紅等采用乙醇沉淀、DEAE－纖維素離子交換層析和Sepharose CL－6B凝膠過濾層析法，從平貝水提取液中分離純化得到水溶性多糖，命名為FUP－1。通過紅外光譜和高效液相色譜對其結構和單糖組成進行初步分析，分子篩層析法測定其分子質量。結果表明，F(xiàn)UP－1為均一組分的雜多糖，主要由木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質的量比為5∶1∶1，平均分子質量為 4.1 ×104D。體外抗氧化活性分析表明，F(xiàn)UP－1具有較強的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力［25］。2012年，Yang＆ Duan從平貝母中分離出1組新的復合成分［26］。

3 繁殖方法

平貝母既可進行有性繁殖，又可用于進行無性繁殖。用種子繁殖生長周期長，收效較慢，一般需6年左右方能收獲，用鱗莖繁殖，2年便可收益，故生產(chǎn)上多采用鱗莖繁殖法［27－28］。利用組織培養(yǎng)的方法進行大規(guī)?？寺》敝常瑹o疑可以減輕對野生植物的采集壓力，同時也是獲大量優(yōu)良種苗的途徑之一。目前的組織培養(yǎng)研究著重于優(yōu)化培養(yǎng)條件，如外植體的取材、培養(yǎng)基成分和激素的選擇試驗。趙國凡等用組織培養(yǎng)的方法，誘導平貝母的不同器官，形成了愈傷組織，鱗莖和植株，為促進平貝母的繁殖速度創(chuàng)造了條件，經(jīng)過對愈傷組織的初步測定，證實有生物堿反應。而當年新鱗莖低溫處理(3～7℃)后進行的組織培養(yǎng)，使進行“二季作”成為可能，同時也為用組織培養(yǎng)的方法進行貝母生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要條件。該試驗證實，植物生長調節(jié)物質對平貝母離體組織的脫分化及其器官再生，具有顯著的調節(jié)作用。試驗還表明，愈傷組織雖經(jīng)多次繼代培養(yǎng)，其分化小鱗莖和小植株的能力仍繼續(xù)保持［29］。唐巍等以平貝母無菌苗幼莖切段誘導產(chǎn)生的愈傷組織為試材，研究了基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、繼代時間及繼代周期時間對愈傷組織分化的影響。結果表明，MS基本培養(yǎng)基有利于不定芽的誘導，MN培養(yǎng)基有利于體細胞胚的誘導。在MN培養(yǎng)墓上，隨著蔗糖濃度的升高，不定芽發(fā)生能力下降，體細胞胚發(fā)生率升高。繼代時間越長，不定芽及體細胞胚的發(fā)生能力均下降。體細胞胚胎發(fā)生的最佳繼代周期時間是21 d，不定芽發(fā)生的最佳繼代周期時間是28 d［30］。此前的另一項研顯示，平貝母愈傷組織繼代過程中染色體變異，并認為染色體遷移是形成超二倍體和四倍體的原因，部分染色質遷移是形成亞二倍體和超二倍體的原因。從再生植株的染色體數(shù)目來看，繼代多次后二暗體細胞頻率仍占85%以上，說明再生植株在遺傳上的穩(wěn)定性。然而，少數(shù)單倍體及四倍體植株的出現(xiàn)對平貝母遺傳育種和作物改良有一定參考價值［31］。2010年，李余先以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素配比進行平貝母鱗莖離體培養(yǎng)對比試驗。結果表明:生長素NAA對形成愈傷組織有主導作用，添加量以0.6 mg/L，較為合適，6－BA和KT對促進芽分化都能起主導作用，6－BA 以0.4 mg/L為好，KT以1.0 mg/L為好，在生根階段，添加2.0 mg/L 的 IBA 較為理想［32］。

4 傳粉生態(tài)學

關于平貝母的傳粉方式等生殖生物學特性方面較少，任躍英等對平貝母開花習性及花粉生命力研究表明，其中以8～12 h開花最多，開花率占全天87.76%，為開花高峰。平貝母柱頭有效期約為8 d，從始花到柱頭進入有效期約需3～4 d，因此花開放4 d后為最適授粉期。不同時期采集的花粉生命力確有差異，并且不論是TTC染色還是基質中萌發(fā)得到一致的趨勢，均表現(xiàn)盛花期的花粉生命力最強［33］。張曉軍等用TTC法測定花粉的活力，用聯(lián)苯胺－過氧化氫法測定柱頭的可授性，通過實地觀測訪花者、套袋實驗、花粉－胚珠比(P/O比)的估算及花粉粒形態(tài)的觀察研究了平貝母的傳粉特性及繁育系統(tǒng)類型。結果表明，平貝母的花粉活力在開花后2～5 d可達90%以上，6 d后有所減弱，10 d后仍有71.3%的花粉保持活力。柱頭的可授期約持續(xù)8 d，在開花后3～4 d柱頭的可授性最強，5 d以后可授性逐漸減弱。平貝母的繁育系統(tǒng)是以自花傳粉為主，蟲媒異花傳粉為輔的兼性自交。研究結果為平貝母的品種選育、雜交育種、引種栽培及物種保育提供了理論和技術依據(jù)，為深入研究貝母屬植物的演化提供了生殖生態(tài)學依據(jù)［34］。

5 分子生物學

2006年，宋顯偉根據(jù)Copia－like類反轉座子反轉錄酶的保守位點設計簡并引物，從平貝母基因組中擴增得到了長度為240bp左右的PCR產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物進行分離和克隆，并隨機挑選76個克隆進行測序，結果得到了57個不同的序列。BlastX分析以及與已鑒定的Copia－like類反轉座子反轉錄酶區(qū)域序列比對表明這些克隆序列均為真實的反轉錄酶序列。進行同源序列的比對發(fā)現(xiàn)，這些序列可分為11組，且這些核苷酸序列在組內(nèi)和組間均有較大的差異，表明核苷酸序列的高度異質性。這57個序列中，僅有12個為完整的序列，其余的都有移碼突變，終止子或二者兼有。Southern雜交結果顯示了各組序列在平貝母基因組中的分布情況。甲基化分析則表明這些序列在平貝母的基因組中均被高度甲基化。該研究認為認為Copia－like類反轉座子在平貝母中以家族的形式廣泛存在，其序列間存在較大的異質性，而且，大部分為不完整的序列，表明這類反轉座子在進化過程中逐漸沉默成為無功能的假基因［35］。李玉鋒通過對不同產(chǎn)地的8種貝母RAPD的分析，探討貝母種間的遺傳差異，結果表明，地理分布距離越小，貝母的遺傳差異越小，反之越大［36］。

6 展望

綜上所述，前人對平貝母的研究涉獵比較廣泛，但作為國家三級瀕危保護植物，其當前野生資源概況并不清楚，保護生物學方面的研究始終未見報道。因此，期待開展相關研究:(1)野生種質資源調查與保存。雖然平貝母的栽培比較普遍，但由于長期的亂采爛挖，其野生資源急劇減少，最突出的問題是野生生境的大面積破壞。因此，有必要對平貝母的種質資源進行全面調查，這對于優(yōu)良品種的選育、穩(wěn)定藥材質量和種質的可持續(xù)利用具有重要意義。(2)遺傳多樣性研究。由于平貝母零星分布，居群間隔大，導致居群間基因流基本上停滯;生境的破壞以及由此引起的種子適合度下降和繁育系統(tǒng)的變化，居群內(nèi)遺傳多樣性的降低將會進一步加劇其對環(huán)境的適應性下降。較弱的生存能力在受到外界的干擾后，很容易導致物種的滅絕，這也要求我們加快對平貝母遺傳多樣性的研究。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005，1:25 －242.

［2］ 謝宗萬.全國中草藥匯編:上冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:230－231.

［3］ 李慧婷.平貝母資源調查與品質評價［D］.沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學碩士學位論文，2010，6:1 －102.

［4］ 陳心啟，許介眉，梁松筠，等.中國植物志:14卷［M］.北京:科學出版社，1980:104.

［5］ 常維春，李景惠，李國英.平貝母生長發(fā)育特性及繁殖方法的觀察研究［J］.特產(chǎn)科學實驗，1982，4:6 －9.

［6］ 朱有昌.東北藥用植物［M］.哈爾濱:黑龍江科學技術出版社，1989:144.

［7］ 吉林省中醫(yī)中藥研究所.長白山植物藥志［M］.長春:吉林人民出版社.1982:1344.

［8］ 李書心.遼寧植物志:下冊［M］.沈陽:遼寧科學技術出版社，1985:699.

［9］ 馬瑩，吳俊，趙巖，等.中心組合設計－響應面分析法優(yōu)選平貝母總生物堿的超聲提取工藝［J］.中國農(nóng)學通報，2012，28(30):306－311.

［10］ 朱丹妮，譚豐萍，高山林.HPLC－ELSD分析測定貝母類藥材中生物堿成分［J］.藥物分析雜志，2000，20(2):87 －91.

［11］ 王沖之，孫健，李萍.貝母類藥材生物堿及生物堿苷含量測定方法研究［J］.中國藥學雜志，2003，38(6):415 －418.

［12］ Li W Y，Bi K S，QiaoY J，et al.Analysis of ipeimine in Bulbus Fritillariae pallidiflorae by HPLC after derivatization［J］.Journal of Chinese Pharm，1997，29:363.

［13］ Li P，Liu L N，Xu GJ，et al.Determination of imperialine in 12 different species of Fritillaria bulbs［J］.Chinese Traditional Herb Drugs，1991，22(9):205.

［14］ Ding K，Lin G，Ho Y P，et al.Prederivatization and high performace liquid chromatographic analysis of alkaloids in bulbs of Fritillaria［J］.Journal of Chinese Pharm，1996，85(11):1174 －1179.

［15］ 陸仁榮.貝母植物堿研究－幾種川貝母中的新植物堿［J］.化學學報，1956，22(3):361.

［16］ 徐東銘，張本，李煥朵，等.平貝母生物堿的分離和鑒定［J］.藥學學報，1982，17(5):355 －359.

［17］ 崔東濱，嚴銘銘，王淑琴.平貝母莖葉化學成分的研究［J］.中國中藥雜志，1995，20(5):298.

［18］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，45(18):5755 －5758.

［19］ Kitamura Y.Alkaloid in Fritillaria ussuriensis.Tennen Yukikgaobustsu Toronkaikoen Yashishu［J］.1989，31(52):6829 －6832.

［20］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，30(3):4981 －4984.

［21］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，45(23):7281 －7283.

［22］ 陳澤乃，陸陽，徐佩娟.中藥貝母中水溶性成分的研究［J］.中國中藥雜志，1996，21(7):420 －422.

［23］ 徐汝明，陸陽.紫外分光光度法測定貝母中腺苷胸苷含量［J］.中國中藥雜志，1997，22(11):682.

［24］ 韓成花，羅惠善，徐東花.平貝母氯仿和乙酸乙酯提取物化學成分的研究［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2008，3:47 －48.

［25］ 劉春紅，馬宇，何忠梅，韓寶瑞.平貝母多糖的分離純化及抗氧化活性研究［J］.食品科學，2011，32(21):29 －33.

［26］ Yang Z D，Duan D Z.A new alkaloid from Fritillaria ussuriensis Maxim.［J］.Fitoterapia，2012，(83):137 －141.

［27］ 張宜軍，劉寶芝，尹振波等，寒地平貝母豐產(chǎn)栽培技術［J］.中國林副特產(chǎn)，1995，5(2):14 －15.

［28］ 那曉婷，陳桂英，楊鴻雁.平貝母的栽培及加工技術［J］.中國林副特產(chǎn)，2001，5(2):3.

［29］ 趙國凡，曹陽，吳陽，等.平貝母的愈傷組織的培養(yǎng)和器官再生［J］.遼寧大學學報:自然科學版，1982，1:88 －96.

［30］ 唐巍，楊映根，桂耀林，等.培養(yǎng)條件對平貝母愈傷組織分化的影響［J］.生物技術，1996，6(4):11 －14.

［31］ 唐巍，吳絳云，張麗梅.平貝母愈傷組織繼代過程中染色體變異的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，1994，25(1):70 －74.

［32］ 李余先，陳凱峰.平貝母鱗莖離體培養(yǎng)研究［J］.北方園藝，2010(3):121－122.

［33］ 任躍英，裴菊，吳玉霞，等.平貝母開花習性及花粉生命力研究［J］.特產(chǎn)研究1996，1:30 －32.

［34］ 張曉軍，崔大練，宗憲春，等.平貝母傳粉生物學及繁育系統(tǒng)的研究［J］.西北植物學報，2010，30(7):1404 －1408.

［35］ 宋顯偉.平貝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)中 Copia－like類反轉座子反轉錄酶序列的克隆與分析［D］.東北師范大學碩士學位論文，2006，5:1 －37.

［36］ 李玉鋒，唐琳，陳放.8種貝母的 RAPD分析［J］.中成藥，2006，28(10):1528 －1529.