王大虎 馬喜興 李艷玲 馬耀輝 李玉平 四榮聯(lián)
(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050000)
端粒(telomere)是位于真核細胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由簡單的DNA串連重復序列和一系列相關(guān)的蛋白質(zhì)組成。端粒作為分子鐘控制著人類細胞的復制與衰老,隨著正常體細胞細胞增殖,端粒酶(telomerase)活性缺如,導致DNA合成的后隨鏈不能有效的復制出染色體3'末端,其端區(qū)長度逐漸縮短。當其長度減小到一定的臨界值時就失去了保護染色體末端的功能,細胞即趨向于衰老、死亡〔1〕。正常細胞內(nèi)檢測不到端粒酶活性,只有在某些特殊細胞中才能檢測到,包括造血細胞、淋巴細胞、皮膚細胞以及生殖細胞等具有增殖潛能的細胞〔2〕。近來研究發(fā)現(xiàn),盡管端粒酶活性主要在大多數(shù)腫瘤中表達,但在某些非惡性皮膚病如銀屑病皮損和常青藤誘發(fā)的皮炎中也有表達的跡象〔3〕。本研究測定銀屑病皮損中端粒DNA長度的表達情況。
1.1 標本來源 所有標本均來自河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚科門診和住院手術(shù)取病理活檢患者30例,經(jīng)臨床及病理確診為尋常型銀屑病患者,分別取病損和病損旁皮膚。其中斑塊狀23例,點滴狀7例。對照組為來自外科整形術(shù)的非暴露部位正常皮膚30例?;颊咂p經(jīng)手術(shù)切取后,一部分送常規(guī)組織學檢查,另一部分立刻固定于70%乙醇溶液用于流式胞術(shù)檢測。
1.2 主要試劑 端粒肽核酸(PNA)探針試劑盒系DAKO公司產(chǎn)品。
1.3 原位雜交 實體組織單細胞懸液制備后,取2×106個細胞,分為實驗組和背景對照組;實驗組加入300 μl含 FITC-(CCCTAA)3PNA探針雜交液,對照組加300 μl空白雜交液,混勻,87℃避光孵育15 min變性;室溫避光過夜雜交;加入1 ml洗液(1∶10 稀釋),混勻4℃孵育10 min,1 500 r/min 離心3 min,棄上清,重復1次;DNA染色加,入0.5 ml PI染液(1∶10稀釋),混勻,4℃避光孵育2 h,400目銅網(wǎng)過濾后進,行流式細胞儀測定。
1.4 流式細胞儀檢測方法 采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics2XLⅡ型流式細胞儀,激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器,激發(fā)波長為488 nm。檢測前以flow-check TM Fluorpheres(10 μm)熒光微球(REF6605359,Beckman Coulter,Inc.Fullerton,CA 92835)作為標準樣品,調(diào)整儀器 CV值在 2%以內(nèi)。
FL1通道檢測FITC熒光強度,F(xiàn)L3通道檢測PI熒光強度,端粒熒光定量即Q-FISH值由減去背景后的G0/G1期二倍體細胞平均熒光強度所決定。Q-FISH值=實驗樣品平均熒光強度-背景對照平均熒光強度。
1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包行t檢驗。
2.1 端粒DNA長度在銀屑病皮損中的表達 FCM檢測的QFISH值分別為28.87±6.57、35.89±8.13和52.46±7.95,銀屑病皮損組端粒長度明顯短于正常皮膚組(P<0.01),銀屑病皮損旁皮膚組端粒長度明顯短于正常皮膚組(P<0.01)。
2.2 端粒DNA長度變化與病變程度相關(guān)性分析 Spearman等級相關(guān)分析顯示,端粒長度與病變程度呈負相關(guān)(r=-0.76,P<0.01)。按照Q-FISH值小于正常組端粒長度80%(<0.76)為縮短,大于正常組織120%(>1.14)為延長的標準劃分,從銀屑病皮損旁皮膚組到銀屑病皮損組端粒縮短的陽性率分別為40.00%(12/30)和73.33%(22/30),呈上升趨勢(P>0.05)。
銀屑病(Psoriasis)俗稱牛皮癬,好發(fā)于頭皮、四肢伸側(cè)及背部。以紅斑鱗屑為基本表現(xiàn),病理表現(xiàn)為表皮細胞的過度增殖和分化。是一種臨床常見的炎癥性、難治性皮膚病,發(fā)病率約2% ~3%。在細胞的過度增殖和分化這一特點上,銀屑病和腫瘤,尤其是惡性腫瘤,有類似和相近的特征。研究表明,正常細胞的生長依賴于細胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的調(diào)控,任何一種調(diào)控因子發(fā)生紊亂都將導致細胞增殖異常,誘發(fā)銀屑病、腫瘤〔4〕。臨床上可以見到由初發(fā)的銀屑病轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤,但是其具體發(fā)病機制如何,相關(guān)文獻中并沒有太多的闡述。
大量研究證實人體大多數(shù)癌和其他惡性腫瘤中均能檢測到端粒酶活性,而良性腫瘤和正常組織體細胞(非生殖細胞)缺乏或存在微弱的端粒酶活性。由于端粒酶活性也可以在炎癥性皮損中檢測到,這說明端粒酶活性并不總是與惡性表型有關(guān)。這方面的研究涉及最多的疾病是異位性皮炎(AD)和銀屑病,盡管在非惡性病變中的端粒酶活性較惡性病變者低得多〔5〕。在非惡性皮膚病皮損中測得端粒酶活性,提示非惡性的上皮細胞亦可有一定的端粒酶活性的激活,并推測與引起病理改變的表皮增生有密切關(guān)聯(lián)。但其機制還不清楚,即在此種情形下端粒酶的表達又是通過何種途徑而激活還不得而知。
正常細胞在致癌因素作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约毎⒉灰馕吨欢苄纬赡[瘤,哺乳動物體內(nèi)有一套精細的調(diào)節(jié)機制控制著細胞的分裂次數(shù),使細胞分裂達到一定程度后死亡。在一些腫瘤中已觀察到,染色體末端的端端融合在腫瘤形成相關(guān)基因的不穩(wěn)定性中起著重要作用,而這種融合可能起因于染色體末端長片段的丟失,如端粒的丟失〔6〕?;谶@種觀點,筆者推斷端粒的縮短可能引起DNA的不穩(wěn)定,激活端粒酶活性而合成端粒DNA加到染色體末端,從而抵消了細胞分裂導致的端粒DNA消耗,并在銀屑病等疾病的形成中起著重要作用。
本研究初步證實,在銀屑病皮損中存在著端粒長度的改變,其表達的強弱與病變進展程度有關(guān),提示端粒長度的改變參與了銀屑病的發(fā)生。
1 Shay JW,Zou Y,Hiyama E.Telomerase and cancer〔J〕.Human Mollar Gene,2001;10:677-85.
2 Cong YS,Shay JW.Actions of human telomerase beyond telomeres〔J〕.Cell Res,2008;18(8):725-37.
3 Baerlocher GM,Mak J,Tient,et al.Telomere length measurement by fluorescence insitu hybridization and flow cytometry:tips and pitfalls〔J〕.Cytometry,2002;47(2):89-99.
4 Jurisic D,Kirin I,Rabic D,et al.The role of telomerase activity in psoriatic skin lesions〔J〕.Med Hypotheses,2007;68(5):1093-5.
5 Queiro R,Alperi M,Alonso-Castro S,et al.Patients with psoriatic arthritis may show differences in their clinical and genetic profiles depending on their age at psoriasis onse〔tJ〕.Clin Exp Rheumatol,2012;30(4):476-80.
6 Tamayo M,Mosquera A,Rego JI,et al.Differing patterns of peripheral blood leukocyte telomere length in rheumatologic diseases〔J〕.Mutat Res,2010;683(1-2):68-73.