張麗花 蔡培泉 王春新

1.張家港市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇張家港 215600；2.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇無錫 214023

廣泛耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類耐藥機制的研究

張麗花1蔡培泉2王春新2

1.張家港市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇張家港 215600；2.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇無錫 214023

目的 調查廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(Extensively drug Resistant Acinetobacter Baumannii，XDR-ABA)臨床分離菌株中氨基糖苷類修飾酶基因、16SrRNA甲基化酶基因和外排泵基因的存在情況。方法 收集2011年1—12月臨床標本中分離的XDR-ABA菌20株，采用微量肉湯稀釋法進行抗菌藥物敏感性試驗，聚合酶鏈反應（PCR）方法分析9種氨基糖苷類修飾酶基因、6種16SrRNA甲基化酶基因和外排泵基因adeB。 結果 20株 XDR-ABA菌均檢出 aac(6’)-Ⅰb、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aphA1和adeB外排泵基因，其余5種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因和均未檢出。 結論 該組20株XDR-ABA菌耐多種氨基糖苷類藥物與細菌產aac(6’)-Ⅰb、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、aphA1 4種氨基糖苷類修飾酶和存在adeABC外排泵系統(tǒng)相關。

鮑曼不動桿菌；氨基糖苷類修飾酶基因；16SrRNA甲基化酶基因；外排泵；廣泛耐藥

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter Baumannii,ABA）是近年來被關注的愈來愈多的機會性致病菌，是醫(yī)院感染的常見致病菌，現(xiàn)在其正緩慢但成功的逐漸成為社區(qū)或健康護理相關感染的常見病原菌，可能引起身體任何部位的感染而不僅僅是一個或兩個系統(tǒng)[1]。從1944年開始首個氨基糖苷類抗生素鏈霉素進入臨床，其殺菌機制主要是通過與30S核糖體亞基解碼區(qū)的16S rRNA連接而抑制蛋白質合成并擾亂細胞膜的完整性[2]。氨基糖苷類對包括鮑曼不動桿菌在內的革蘭陰性桿菌具有強大的抗菌活性，但近年來鮑曼不動桿菌的耐藥性迅速發(fā)展而致對氨基糖苷類敏感性下降[3-4]。為了進一步了解ABA對氨基糖苷類的耐藥機制，我們對該院分離的20株ABA進行了氨基糖苷類耐藥相關基因的檢測，包括9種氨基糖苷類修飾酶基因 （aac3-Ⅰ、aac3-Ⅱ、aac6’-Ⅰad、aac6‘-Ⅰb、aac6’-Ⅱ、ant2’’-Ⅰ、ant3‘‘-Ⅰ、ant4’-Ⅰ、aph3 ‘-Ⅰ）、6 種 16S rRNA 甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）以及 1 種外排泵基因（adeB），現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株

20株ABA菌株全部來自2011年1—12月無錫市人民醫(yī)院住院患者的臨床標本，標本分布為：痰液17份，尿液2份，血液1份。

1.2 細菌鑒定和藥敏試驗

所有菌株鑒定和藥敏試驗采用VITEK-compact全自動微生物分析系統(tǒng)，由于生化分析法不能區(qū)分ABA與乙酸鈣不動桿菌，該研究并作了gyrA和parC基因擴增與產物測序(gyrA基因引物為[P1:5’-AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT-3’；P2:5’-GCCATACCTACGGCGATACC-3’]和 parC 基因引物為[P1:5’-AAACCTGTTCAGCGCCGCATT-3’；P2:5’-AAAGTTGTCTTGCCATTCACT-3’])，測得序列經BLASTn比對進一步確認為ABA，試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。藥敏試驗抗菌藥物包括：阿米卡星、氨芐西林、頭孢唑肟、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、慶大霉素、亞胺培南、左旋氧氟沙星、美羅培南及哌拉西林/他唑巴坦。質控菌株為鮑曼不動桿菌ATCC19606，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。20株ABA對15種抗菌藥物均呈耐藥。對篩選出的20株AB利用微量肉湯稀釋法對多粘菌素B和E進行敏感性測定，均為敏感。根據(jù)文獻[5]，判定該組ABA為廣泛耐藥鮑曼不動桿菌（Extensively drug Resistant Acinetobacter Baumannii,XDR-ABA）。

1.3 細菌處理

挑純培養(yǎng)菌落置入0.5 mL離心管內 （內預置200 ng/mL蛋白酶K溶液 400 μL）,56℃水浴2 h，改95℃水浴10 min。即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測

9 種氨基糖苷類修飾酶基因（aac3-Ⅰ、aac3-Ⅱ、aac6’-Ⅰad、aac6 ‘-Ⅰb、aac6’-Ⅱ、ant2’’-Ⅰ、ant3 ‘‘-Ⅰ、ant4’-Ⅰ、aph3‘-Ⅰ）、6 種 16S rRNA 甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA）和外排泵基因（adeB）的檢測均為PCR法。PCR擴增試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供，檢測按說明書進行。

1.5 陽性基因測序

PCR陽性產物由PCR直接全自動熒光法測序，委托上海鉑尚生物技術有限公司完成 (測序在美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀上進行。

1.6 測得序列比對

讀序工具軟件為Chromas，測序結果用Chromas直接作BLAST Search比對。

2 結果

20株XDR-ABA檢測陽性的基因為4種氨基糖苷類修飾酶基因（aac6‘-Ⅰb、ant2’’-Ⅰ、ant3‘‘-Ⅰ和 aph3‘-Ⅰ）和 1 種外排泵基因（adeB），而其它的5種氨基糖苷類修飾酶基因和全部的6種16S rRNA甲基化酶基因的檢測均為陰性。aph3‘-Ⅰ型氨基糖苷類修飾酶基因序列與文獻報道一致[6]，aph3‘-Ⅰ基因測序圖（部分）見圖 1。

3 討論

鮑曼不動桿菌作為醫(yī)院感染的重要病原菌的主要原因為：①鮑曼不動桿菌通過不同的途徑積聚多種耐藥機制的卓越能力，包括突變和獲得遺傳元件，如質粒、整合子、轉座子或耐藥基因島；②可長時間在環(huán)境中生存的能力，并聯(lián)合其固有的耐干燥和消毒劑的能力，且其形成生物膜的能力也有幫助[7]。國內的一個包括1 879株革蘭陰性桿菌的研究顯示，鮑曼不動桿菌的檢出率為14.37%（395株），而對氨基糖苷類的耐藥率為57.91%～100.00%，從2004—2011年對奈替米星和妥布霉素的敏感率呈逐年下降趨勢[8]。美國報道的包括29家醫(yī)院的調查顯示，從2002—2009年期間氨基糖苷類抗生素的平均使用量下降了41%，但鮑曼不動桿菌對其耐藥率無明顯變化[9]，顯示鮑曼不動桿菌耐氨基糖苷類抗生素的嚴峻形勢。

圖1 aph3‘-Ⅰ基因測序圖（部分）

對氨基糖苷類的耐藥機制有：①產生修飾或滅活氨基糖苷類抗生素的轉移酶或鈍化酶，如乙?；负土姿峄?；②氨基糖苷類抗生素的靶位改變；③細胞膜通透性改變或細胞內轉運異常，使得藥物在細胞內積累減少從而導致耐藥，如外排泵的過表達[2]。鮑曼不動桿菌修飾氨基糖苷類的酶包括乙酰轉移酶（Aminoglycoside Acetyltransferases，AAC）、核苷酸轉移酶（Aminoglycoside Nucleotidyltransferases，ANT） 和磷酸轉移酶（Aminoglycoside Phosphotransferases，APH）。該實驗中的鮑曼不動桿菌藥敏試驗顯示其對阿米卡星和慶大霉素耐藥，且三種修飾酶均有檢測到，表明鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗生素的修飾是多機制的。近來有研究顯示在AAC以及腺嘌呤轉移酶（Aminoglycoside Adenyl Transferase，AAD）的編碼基因的領導（leader）RNA 中存在核糖開關（riboswitch），抗生素連接到領導RNA上可誘導氨基糖苷類耐藥[10]。該實驗共檢測出了4種氨基糖苷類修飾酶基因，其中的aph3‘-Ⅰ型氨基糖苷修飾酶為該院許亞豐等人發(fā)現(xiàn)的新的磷酸轉移酶基因（美國Genbank登錄號為JF519620，2011年5月1日公布）。該實驗所檢測出的4種氨基糖苷類修飾酶基因與許亞豐等人檢測的結果一致，且序列對比亦顯示無有義突變。

從2003年至今已鑒定出7種16S rRNA甲基化酶基因，包括 armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE 和 npmA11。 報道顯示高度耐阿米卡星(≥512 μg/mL)的革蘭陰性菌有 97.5%（193/198）攜帶16S rRNA甲基化酶基因[11]，但我們試驗中的鮑曼不動桿菌均未檢測出16S rRNA甲基化酶基因，雖然藥敏試驗顯示均耐阿米卡星，表明攜帶16S rRNA甲基化酶基因的鮑曼不動桿菌尚未在該院造成流行。

一個包括1189株來自南非、歐洲、中國、拉丁美洲和地中海國家的不動桿菌屬的大型研究顯示98%的分離株攜帶多藥外排運輸系統(tǒng)AdeABC12。慶大霉素和奈替米星是AdeABC外排泵的最佳底物，3個連續(xù)的成群基因adeA、adeB和adeC編碼的蛋白質分別同源于膜融合、藥物轉運體和外膜成分，這是耐藥結節(jié)細胞分裂（Resistance-Nodulation-cell Division，RND）外排泵家族的特性[13]。adeABC的表達是受一個兩成分的系統(tǒng)AdeRS所調控的，這個系統(tǒng)包括一個反應調節(jié)者（AdeR）和一個感受器激酶（AdeS），慶大霉素存在時adeS和adeR發(fā)生突變而使得adeABC的表達增多而產生耐藥[14]。在外排泵抑制劑1-(1-萘基甲基)-哌嗪（1-(1-Naphtylmethyl)-Piperazine，NMP）存在的情況下一株耐慶大霉素的鮑曼不動桿菌變?yōu)橹薪槟退?，NMP雖然增大了抑菌圈的直徑卻不足以恢復敏感性[15]。我們的實驗顯示所有的20株XDRABA均攜帶adeB基因且均對慶大霉素耐藥，而慶大霉素的修飾酶罕有報道，因此可初步判斷adeB基因的存在是該研究中XDR-ABA耐慶大霉素的原因。

該實驗從鮑曼不動桿菌耐氨基糖苷類的三個機制方面分別進行了研究，檢測陽性的有4種氨基糖苷類修飾酶基因和1種外排泵基因，而16SrRNA甲基化酶基因的檢測為陰性，顯示該院流行的鮑曼不動桿菌耐氨基糖苷類抗生素是兩種機制聯(lián)合造成的。

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Study on Aminoglycoside Antibiotic Resistant Mechanism in Extensively Drug Resistant Acinetobacter Baumannii

ZHANG Lihua1CAI Peiquan2WANG Chunxin2
1.Clinical Laboratory,Zhangjiagang First People's Hospital,Suzhou,Jiangsu Province,215600，China;2.Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi,Jiangsu Province,214023，China

Objective To investigate the distribution of aminoglycoside modifying enzyme genes,16SrRNA methylase genes and adeB efflux pump gene in extensively drug resistant acinetobacter baumannii(XDR-ABA).Methods From January,2011 to December,2011,20 strains of XDR-ABA were collected from clinical specimen.Antimicrobial susceptibility test was performed by broth microdilution method and 9 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes,6 kinds of 16SrRNA methylase genes and adeB efflux pump gene were analyzed by PCR.Results All 20 strains of XDR-ABA were positive for 4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes aac(6')-Ⅰb,ant(2")-Ⅰ,ant(3")-Ⅰand aphA1 and adeB efflux pump gene,negative for other 5 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes and 6 kinds of 16SrRNA methylase genes in PCR assays.Conclusion In this group of XDR-ABA,4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes aac(6')-Ⅰb,ant(2")-Ⅰ,ant(3")-Ⅰand aphA1 and adeB efflux pump system might play a role in resistance to aminoglycoside antimicrobial agents.

Acinetobacter baumanii;Aminoglycoside modifying enzyme gene;16SrRNA methylase gene;Efflux pump;Extensive drug resistance

R450

A

1674-0742（2013）12（b）－0010-02

無錫市醫(yī)院管理中心醫(yī)學技術聯(lián)合攻關項目(YGZX1212)；南京醫(yī)科大學科技發(fā)展基金重點項目（2012NJMU171）。

張麗花（1971-），女，江蘇張家港人，副主任技師，研究方向：臨床微生物檢測。

王春新，副研究員，副主任技師，研究方向：臨床微生物檢測，E-mail：wangcx_wxph@163.com。

2013-10-28）