張承旻(綜述)，廖文波(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨二科，貴州 遵義 563099)

·綜述·

異種骨去抗原處理的研究進(jìn)展

張承旻(綜述)，廖文波(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨二科，貴州 遵義 563099)

異種骨；免疫原性；抗原；脫細(xì)胞骨基質(zhì)

創(chuàng)傷、腫瘤、感染及其它因素可以導(dǎo)致骨缺損，而骨移植是治療骨缺損最有效的方法之一[1]。用于骨移植的材料有：自體骨、同種異體骨、異種骨及組織工程化骨等。自體骨及同種異體骨是目前臨床主要應(yīng)用的骨移植材料，但均有其不足之處[2-5]。近年來的研究表明，異種骨具有天然的三維孔隙結(jié)構(gòu)、恰當(dāng)?shù)拟}磷比例、骨誘導(dǎo)能力及生物力學(xué)與人相似[6-7]，是理想骨移植材料的來源。但其為異種材料，植入人體內(nèi)可引起急性排斥反應(yīng)。因此,如何降低異種骨免疫原性是其成為骨移植代替材料的關(guān)鍵?，F(xiàn)就目前異種骨去抗原處理方法的研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1 異種骨抗原分布及免疫反應(yīng)類型

異種骨主要含有抗原：α-半乳糖基抗原(α-Gal)、主要組織相容性抗原(MHC)、膠原蛋白及骨髓和血液成分[8-9]。異種材料植入人體后，與人體血液直接接觸，激活血液內(nèi)含有的α-半乳糖基天然抗體，其所介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，引起移植物血管內(nèi)皮細(xì)胞溶破、血栓形成及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)；但是異種骨移植后并不直接暴露于血液中，所以異種骨移植后并不出現(xiàn)明顯的超急性排斥反應(yīng)。由于異種材料與人體的MHC分子差異較大，細(xì)胞因子及其受體不匹配，難以通過直接識(shí)別途徑激發(fā)免疫應(yīng)答，所以排斥反應(yīng)主要通過間接識(shí)別途徑而發(fā)生。通過CD4+Th細(xì)胞識(shí)別自身抗原提呈細(xì)胞提呈的異種MHC-II單態(tài)和多態(tài)決定簇，通過Th1、Th2細(xì)胞作用，發(fā)生急性排斥反應(yīng)。較同種排斥相比，其反應(yīng)更強(qiáng)烈，不易被免疫抑制劑所抑制。目前認(rèn)為異種骨移植引起排斥反應(yīng)主要是α-Gal抗原[10-11]和MHC抗原[12]，通常認(rèn)為I型膠原蛋白各種屬之間差別不大，并沒有很強(qiáng)的抗原性。其中α-Gal、MHC-I抗原表達(dá)于骨髓細(xì)胞及骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞細(xì)胞膜上及哈弗氏管周圍，MHC-II抗原表達(dá)于骨髓細(xì)胞。所以如何更好的制備脫細(xì)胞異種骨支架材料是降低異種骨免疫原性的主要方式。

2 異種骨去抗原處理方法

異種骨去抗原主要是通過脫細(xì)胞處理，處理目的是有效的去除所有細(xì)胞及核質(zhì)，并將對(duì)支架的組成成份、生物活性和機(jī)械完整性的干擾減到最弱以保留基質(zhì)成分[13]。目前任何處理脫細(xì)胞處理方式都將影響支架材料的生物特性，常用的方法包括物理、化學(xué)方法[14-16]。物理方法分為：高溫煅燒、低溫冷凍、機(jī)械攪拌及聲波降解等方法，這些方法破壞細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)成份釋放，然后進(jìn)一步從支架上去除細(xì)胞內(nèi)成分。但是，僅僅應(yīng)用物理方法并不能完全去除細(xì)胞，一般需聯(lián)合化學(xué)方法。此外，蛋白酶可以水解細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與支架之間的纖連蛋白、彈性蛋白和黏多糖等連接成分，使細(xì)胞與支架分離，從而達(dá)到脫細(xì)胞目的[17]。目前對(duì)異種去抗原處理方法通常采用不同的物理、化學(xué)及酶方法聯(lián)合使用，但是各種方式對(duì)異種骨支架的脫細(xì)胞處理同時(shí)也不同程度的影響到了異種骨材料天然生物特性。如H2O2可以有效的降低異種骨的免疫原性，但是在免疫原性減低的同時(shí)異種骨的強(qiáng)度、彈性模量也受到了影響，其彈性變形能力較差，脆性增加。

2.1 物理方法 異種骨物理處理方法有高溫煅燒、低溫冷凍及超聲等方法。高溫煅燒骨是將異種骨脫脂脫蛋白處理后在經(jīng)過高溫煅燒，除去了膠原等有機(jī)成分使異種骨的免疫原性減低。經(jīng)過煅燒的異種骨主要成分是高純度的羥基磷灰石，因?yàn)橛袡C(jī)成分都被除去，所以高溫煅燒后可使骨力學(xué)強(qiáng)度低、脆性大、可降解。Kim等應(yīng)用高溫煅燒骨在體外及動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)成骨，認(rèn)為其具有較強(qiáng)的骨傳導(dǎo)性，但是無骨誘導(dǎo)性[18]。Lin等將異種骨放入焦磷酸鈉溶液中浸泡后高溫煅燒，骨中的羥基磷灰石與焦磷酸鈉反應(yīng)轉(zhuǎn)變成為磷酸鈉三鈣，提高了高溫煅燒骨的生物降解性與細(xì)胞相容性[19]。由于高溫煅燒降低了骨的力學(xué)性能，所以一般不用于負(fù)重部位植骨，因其可誘導(dǎo)骨生成，常作為填充材料。

低溫冷凍是一種常用的脫細(xì)胞處理方法，一般推薦溫度低于-70～-80 ℃。低溫冷凍使異種骨免疫原性減低，其機(jī)制并不十分明確，有學(xué)者認(rèn)為低溫時(shí)細(xì)胞內(nèi)生成的冰晶，可以破壞細(xì)胞膜引起細(xì)胞的溶解，從而降低了異種骨的免疫原性[20]。于洪波等將兔成骨細(xì)胞液氮凍存3月后復(fù)蘇，比較凍存前后細(xì)胞的MHC分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凍存后細(xì)胞的MHC-I分子的表達(dá)減低，認(rèn)為凍存可以降低細(xì)胞的免疫原性。但是，低溫冷凍方法對(duì)異種骨材料的生物力學(xué)影響具有爭議，Kang等通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為低溫冷凍及反復(fù)凍融對(duì)牛皮質(zhì)骨條生物力學(xué)無明顯的影響[21]。

超聲生物技術(shù)包括超聲碎細(xì)胞和超聲洗滌等技術(shù)，在生物研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。超聲波可以引發(fā)強(qiáng)烈的震動(dòng)，同時(shí)還有高速化、空化效應(yīng)和攪拌作用。在一定的強(qiáng)度和頻率條件下超聲波在液體中傳播產(chǎn)生許多微小氣泡，暴露在聲場(chǎng)中的氣泡先迅速膨脹到最大半徑，然后被迅速壓縮并瞬間崩潰閉合產(chǎn)生瞬時(shí)的高溫、高壓及強(qiáng)烈的沖擊波與激射流將細(xì)胞擊碎。目前的研究尚沒有一個(gè)統(tǒng)一的頻率和強(qiáng)度來破壞細(xì)胞[22]，趙自平等采用20kHz的較低頻率進(jìn)行超聲碎細(xì)胞處理，然后采用40kHz的頻率清除細(xì)胞碎片，經(jīng)過聯(lián)合化學(xué)法脫脂脫蛋白處理，所制備的異種骨脫細(xì)胞支架經(jīng)過檢測(cè)，生物力學(xué)與傳統(tǒng)方法相比生物力學(xué)沒有差異，經(jīng)過體外及動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，經(jīng)過超聲處理的異種骨脫細(xì)胞支架免疫原性低、細(xì)胞相容性好。較常規(guī)方法，超聲方法協(xié)助處理脫細(xì)胞更徹底，而且縮短了異種骨支架材料制備周期，不影響支架材料的生物力學(xué)性能[23]。探索超聲去除異種松質(zhì)骨抗原的最佳頻率與強(qiáng)度，這是研究該應(yīng)用技術(shù)的關(guān)鍵和重點(diǎn)。

2.2 化學(xué)方法 化學(xué)方法對(duì)異種骨支架材料進(jìn)行脫脂、脫蛋白或脫細(xì)胞處理，主要是采用不同化學(xué)試劑浸泡異種骨，如：甲醇、氯仿、乙醚、過氧化氫。通過不同試劑共同作用制備部分脫蛋白骨、完全脫脂脫蛋白骨及脫細(xì)胞骨基質(zhì)等。常用的脫脂化學(xué)試劑有乙醚、氯仿、甲醇及甲醛等有機(jī)溶劑，脫蛋白試劑有過氧化氫、乙二胺等。

1937年首次出現(xiàn)脫蛋白骨應(yīng)用于臨床后[24]，化學(xué)法脫脂脫蛋白技術(shù)在不斷更新，其中完全脫脂脫蛋白骨：Bio-oss骨、Oswestry骨等已應(yīng)用于臨床并取得了一定的效果，但是都未能廣泛應(yīng)用[25-26]。完全脫脂脫蛋白通常將異種骨浸泡于過氧化氫液或乙二胺中，從而提取其中蛋白成分。經(jīng)過完全脫脂脫蛋白處理后異種骨的免疫原性明顯下降，實(shí)驗(yàn)證明移植后不會(huì)引起強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，但是同時(shí)因?yàn)楣侵Ъ苤械挠袡C(jī)成分幾乎全部被清除掉，經(jīng)過處理的支架材料幾乎沒有骨誘導(dǎo)性。在成骨方面受到了限制。Kiel骨是一種脫脂部分脫蛋白的異種骨，其采用新鮮牛骨，機(jī)械方式去除軟組織及骨髓，浸泡于H2O2中去除部分蛋白，再用乙醇脫脂處理后干燥獲得。經(jīng)過處理后的骨支架材料免疫原性低，因?yàn)椴糠置摰鞍祝Ъ懿牧仙先员Ａ舨糠值鞍壮煞?，提高了支架材料的骨誘導(dǎo)作用。在歐洲Kiel骨已經(jīng)商品化應(yīng)用與臨床[27]。

在脫脂脫蛋白處理中，采用H2O2進(jìn)行脫蛋白處理非常普遍，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2作用時(shí)間越長，異種骨支架的免疫原性也就越低，但是支架材料的生物力學(xué)強(qiáng)度也明顯的降低[28]。在骨基質(zhì)中氨基酸總量隨著H2O2處理時(shí)間的延長并沒有明顯的變化，沒有出現(xiàn)大量蛋白質(zhì)被去除的現(xiàn)象。所以目前認(rèn)為H2O2作用機(jī)制可能是其強(qiáng)氧化作用使得支架材料上的蛋白發(fā)生變性，并沒有起到脫蛋白的作用。異種骨中的主要有機(jī)成分I型膠原蛋白是維持骨韌性重要成分，其在H2O2作用下發(fā)生變性，可使得異種骨的脆性增加，強(qiáng)度降低[29]。

非離子洗劑Triton X-100是一種廣泛使用的脫細(xì)胞洗劑，作用時(shí)間根據(jù)不同的組織從幾個(gè)小時(shí)到兩周。它主要是通過破壞脂類之間和脂類與蛋白之間的相互作用，經(jīng)過處理后除去了基質(zhì)材料上的脂類，有效保留了蛋白物質(zhì)。用Triton X-100處理血管可以有效的除去血管內(nèi)的細(xì)胞并保存血管的結(jié)構(gòu)。王昊等采用Triton X-100處理異種骨，經(jīng)過免疫組織化學(xué)檢測(cè)異種骨中膠原蛋白被保留；HE染色間骨陷窩空虛，骨細(xì)胞被除去；力學(xué)檢測(cè)經(jīng)過處理的異種骨支架材料與正常骨相似[30]。但是Triton X-100脫細(xì)胞處理的過程中同時(shí)除去了支架材料中的黏多糖成分，不利于細(xì)胞的粘附[31]。

采用化學(xué)法降低異種骨材料的免疫原性主要是通過將異種骨浸泡于不同的試劑中，但是單純的浸泡一方面提取液不易達(dá)到異種骨內(nèi)部，另一方面提取液隨著作用時(shí)間的延長，其濃度降低。一般采用物理攪拌、震蕩及超聲等方法與化學(xué)法聯(lián)合應(yīng)用，可以明顯提高化學(xué)試劑的作用效率，縮短處理時(shí)間。

2.3 酶消化法 胰酶為蛋白酶的一種，作為消化酶而起作用。是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，從而起到消化酶的作用。胰酶可以使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。經(jīng)常作為一種脫細(xì)胞的處理方法。何創(chuàng)龍等采用蛋白酶代替H2O2等強(qiáng)氧化劑處理異種骨，有效的保留了膠原蛋白[32]。但是胰酶等蛋白酶長時(shí)間作用會(huì)清除異種骨中的連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和黏多糖等成分。此外，使用蛋白酶需要控制提取液的pH值及溫度等條件，使得蛋白酶可以有效的發(fā)揮其作用。

3 展望

異種骨來源廣泛可以大量提供，天然的骨結(jié)構(gòu)及其孔隙有利于細(xì)胞的粘附及增殖，生物力學(xué)與人骨相似，較其它來源的植骨材料有著其自身的優(yōu)勢(shì)，可成為理想的骨替代材料[33]。現(xiàn)有的物理、化學(xué)及酶的處理方式可以有效的降低異種骨的免疫原性，但同時(shí)影響了異種骨的骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及生物力學(xué)性能等天然特性。由于這個(gè)原因，異種骨在作為骨代替材料的應(yīng)用上受到了明顯的限制。因此，目前需要解決的首要問題是如何有效的降低異種骨免疫原性，并且最大限度的保護(hù)異種骨的天然特性。

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[收稿2012-09-26;修回2012-12-28]

(編輯：王福軍)

R683

A

1000-2715(2013)02-0170-04

廖文波,男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:骨質(zhì)疏松, E-mail:wenbo600@sina.com。