王敬龍 金巨樓 杜冰 毛智 王樹平 劉志輝

胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta derived mesenchymal stem cell，PMSC）是近幾年來受到學(xué)者普遍關(guān)注的一種新的成體干細(xì)胞。胎盤，這一在胎兒娩出后被“廢棄”的人體器官，不僅來源豐富、取材方便、產(chǎn)婦知情同意后無倫理限制，而且具有造血支持及免疫抑制等諸多優(yōu)點(diǎn)，使PMSC成為間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）中倍受關(guān)注的一種。隨著對PMSC研究的深入，筆者發(fā)現(xiàn)其分離培養(yǎng)方法多種多樣，莫衷一是，對其生物學(xué)性狀的闡述也不盡相同。鑒于此，本文對PMSC的分子生物學(xué)特性做一綜述。

一、PMSC的來源

MSC來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，而胎盤的主體部分為羊膜及絨毛膜中胚層，提示胎盤為MSC很好的生物來源。Zhang等[1]討論了MSC在胎盤中的存在。人胎盤是一種由胎兒組織與母體組織共同組成的器官，羊膜和絨毛膜來源于胎兒，蛻膜則起源于母體，所以研究胎盤的細(xì)胞存在應(yīng)區(qū)分其不同來源。苗宗寧等[2]研究顯示臍帶附著處下方胎盤組織相對于其他部位更易獲取較多的MSC。In′t Anker等[3]首先報道了中期妊娠羊水是 MSC臨床應(yīng)用的含量豐富的來源。對比羊水來源以及羊膜來源的MSC發(fā)現(xiàn)，二者的生長特點(diǎn)及生長曲線相近。這些現(xiàn)象一方面說明胎盤中的確存在MSC，另一方面提示羊水中MSC極有可能來源于羊膜等實體組織。Miki等[4]研究證實羊膜上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特性并表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因。

另外，取材部位的不同將影響所獲取的MSC的數(shù)量及其增殖分化能力[5]。目前研究的PMSC，多是指胎兒面的PMSC，即羊膜和絨毛膜部位的細(xì)胞，但也有人報道了對母體來源的胎盤細(xì)胞即蛻膜部位的細(xì)胞的研究，認(rèn)為其具有多能性、肌纖維母細(xì)胞性、來源廣、保存容易等特點(diǎn)[6-7]。

二、PMSC的分離方法

由于胎盤的結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣、細(xì)胞成分復(fù)雜，包括各種滋養(yǎng)細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、Hofbauer細(xì)胞及各種血細(xì)胞等，因此在分離培養(yǎng)過程中受其他細(xì)胞干擾的情況嚴(yán)重。目前常用的PMSC分離方法主要有酶消化法、組織塊培養(yǎng)法和整體灌注法。

1.酶消化法：酶消化法應(yīng)用最為廣泛，常使用的酶消化法是先將組織剪碎，用酶消化后制成細(xì)胞懸液，再以密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法進(jìn)行分離。由于PMSC表面標(biāo)志不夠特異，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法會造成大量細(xì)胞損失，且成本高。貼壁篩選法是利用PMSC貼壁生長的特性，通過貼壁培養(yǎng)及傳代，使細(xì)胞逐漸得到純化。密度梯度離心法則是利用細(xì)胞密度的差別，分離出密度在一定范圍內(nèi)的細(xì)胞[8]。由于胰蛋白酶是通過離解細(xì)胞間的黏蛋白和糖蛋白來破壞細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離，因此會對細(xì)胞活力產(chǎn)生一定的影響。而膠原酶主要離解細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸-中性氨基酸-甘氨酸-脯氨酸多肽，對間質(zhì)細(xì)胞影響較小[9]。PMSC消化所用的酶通常為膠原酶Ⅱ或Ⅳ，目前大多數(shù)實驗都采取膠原酶Ⅳ進(jìn)行消化。陸琰等[8]研究顯示，使用膠原酶Ⅱ消化胎盤組織，結(jié)合羥乙基淀粉沉淀法能更好的分離PMSC。Bailo等[10]用胰蛋白酶、離散酶、DNA酶及膠原酶多次重復(fù)消化，促進(jìn)細(xì)胞游離以達(dá)到獲得MSC的目的。

2.組織塊培養(yǎng)法：該方法將組織剪碎后不經(jīng)過酶處理，直接放在培養(yǎng)皿中使其貼壁生長。為提高細(xì)胞富集效率，F(xiàn)ukuchi等[11]采用外植胎盤組織塊法促進(jìn)細(xì)胞貼壁；In′t Anker等[12]用 10 cm2羊膜或10 cm2蛻膜組織采用培養(yǎng)基中添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子及1﹪明膠包被培養(yǎng)板法，成功分離獲得MSC。李棟等[13]研究顯示，組織塊培養(yǎng)法雖然簡便易行，但其弱表達(dá)CD29和CD105，僅能向脂肪細(xì)胞分化。而酶消化法所得細(xì)胞符合MSC特征。但同時有其他研究表明[14]兩種方法得到的PMSC表面標(biāo)志表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。且組織塊培養(yǎng)法較酶消化法節(jié)省了消化組織等步驟，大大節(jié)省了操作時間，不僅避免了長時間酶消化對細(xì)胞的損傷，也避免了由于長時間操作而導(dǎo)致污染幾率增加的危險。目前兩種方法沒有定論，實驗多采用酶消化法，具體優(yōu)劣需隨著時間的推進(jìn)加以印證。

3.整體灌注法：張毅等[15]用含肝素鈉的IMDM經(jīng)臍血管循環(huán)形成灌流途徑，去除胎盤內(nèi)殘留的臍血，然后在無菌條件下將胎盤置于培養(yǎng)基中室溫浸泡過夜，采用密度梯度離心法從組織浸出液中分離液獲得MSC，這種方法得到的MSC大小均勻，純度較高。李芳等[16]以D-Hank液灌注，在一定的壓力作用下，首先去除紅細(xì)胞干擾，其次破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，暴露內(nèi)皮下組織。收集培養(yǎng)的細(xì)胞即來自血管內(nèi)皮以及內(nèi)皮下組織。流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志以及多向誘導(dǎo)分化的實驗結(jié)果與酶消化分離培養(yǎng)的PMSC相同，并且生長速度更快，PMSC純度更高。由于灌注后獲取的細(xì)胞數(shù)量多，且成分相對單一，所以培養(yǎng)后PMSC純度高，其它細(xì)胞干擾較少。但需要胎盤組織完整不能有破損然而胎盤組織體積大，無菌操作要求更高，所以整體灌注的方法有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

三、PMSC的生物學(xué)特性鑒定

1.表面標(biāo)志及基因表達(dá)：目前各學(xué)者對PMSC表面標(biāo)志的鑒定多集中在整合蛋白家族CD29、透明質(zhì)酸受體CD44、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD73、CD105以及 CD166，SH-2/CD105，SH-3，SH-4的高表達(dá)上[8，14，16，17，18]；此外，絨毛膜來源 MSC 還表達(dá)某些多潛能轉(zhuǎn)錄因子，如Sox-2、Nestin；CD106可有高表達(dá)、低表達(dá)或不表達(dá)，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45、CD14、HLA-DR和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vWF、Flk-1、CD31以及特殊滋養(yǎng)層細(xì)胞的表面標(biāo)志等。Bailo等[10]對羊膜及絨毛膜細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，羊膜及絨毛膜細(xì)胞共同表達(dá)的表面標(biāo)記為 CD105，CD44，CD90，CD54，CD73，CD29。令人感興趣的是，PMSC可以表達(dá)某些胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)記如SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，提示PMSC可能是非常原始的細(xì)胞群，具有更廣泛的自我更新和多系分化能力。另外有學(xué)者還進(jìn)行了一系列細(xì)胞表面共刺激因子的檢測，發(fā)現(xiàn)包括 CD80、CD86、CD40/40L、B7/CD28、ICOS、4-1BB等在內(nèi)的共刺激分子在PMSC均不表達(dá)，表明PMSC免疫原性很低[19-20]。Fukuchi等[11]也用RT-PCR技術(shù)分析培養(yǎng)了2～18代的PMSC的不同基因，結(jié)果顯示其基因表達(dá)與骨髓來源的MSC很相似，可同時檢測出3個胚層的基因表達(dá)即器官特異性基因表達(dá)、造血內(nèi)皮基因表達(dá)、干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)。Parolini等[21]提出了鑒定PMSC的最基本標(biāo)準(zhǔn)即貼壁生長，成纖維樣細(xì)胞形成菌落的能力，表達(dá)基本的特異性表面標(biāo)志，如CD90、CD73、CD105，不表達(dá) CD45、CD34、CD14和HLA-DR，向一兩個譜系的細(xì)胞分化的能力，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胚胎起源的細(xì)胞等。

2.生長曲線及細(xì)胞周期：通過其生長曲線測定，傳代后潛伏期約為 24～48h，細(xì)胞倍增時間約為36～48h，細(xì)胞周期分析顯示，僅少數(shù) PMSC 處于分裂期，約95﹪的細(xì)胞處于G0/G1期。這一部分細(xì)胞保留自我更新和增殖能力，符合干細(xì)胞特性[22]。

3.多向誘導(dǎo)分化能力：因骨組織、脂肪、軟骨主要來源于中胚層，所以體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、脂肪及軟骨的能力可能是細(xì)胞鑒定最基本和最關(guān)鍵的要求[5]。劉春麗等[23-25]通過實驗證實PMSC在特定誘導(dǎo)環(huán)境下不僅可以向成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞定向分化，而且在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)可以向創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞——內(nèi)皮細(xì)胞定向分化。有研究表明PMSC也可向外胚層細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和類神經(jīng)性細(xì)胞、心肌細(xì)胞及肝細(xì)胞分化[26-27]。

4.免疫抑制特性：由于胎盤來源的MSC一般不表達(dá)HLA-DR抗原，說明PMSC是免疫原性極低的細(xì)胞[28]。將羊膜及絨毛膜細(xì)胞移植入新生的豬和鼠體內(nèi)，通過兩種人重復(fù)DNA區(qū)域進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)這兩種動物體內(nèi)多個器官都可檢測到微小嵌合體[10]，說明PMSC不僅具有低免疫性，而且可以抑制其他細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，即具有免疫抑制性。圍繞免疫抑制的機(jī)制存在很多的爭論，如誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡學(xué)說、Fas受體學(xué)說和劑量依賴學(xué)說等[29-31]。以上這些機(jī)制都沒有定論，有可能是共同作用使PMSC具有免疫抑制性。

四、PMSC與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的比較

BMSC具有多向分化潛能，是組織工程、細(xì)胞移植和基因治療中研究的熱點(diǎn)。在細(xì)胞形態(tài)、貼壁生長、表達(dá)CD29、CD105、CD166和不表達(dá)CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR等方面，PMSC和BMSC生物學(xué)特性表現(xiàn)相同或相似[32]。BMSC體外培養(yǎng)方法簡單，增殖速度快，但成人BMSC含量低，隨著年齡增加其數(shù)量及增殖分化能力會隨之衰退，且多次取材對患者有損傷，這些都限制了BMSC在基礎(chǔ)及臨床上的應(yīng)用。相反，PMSC易分離培養(yǎng)，增殖迅速，可以向多種組織細(xì)胞分化。與捐獻(xiàn)骨髓或采集動員外周血相比，供者無痛苦，感染機(jī)會少。利用骨髓提取干細(xì)胞，受者的血型必須與骨髓捐贈者非常接近，才能不產(chǎn)生排斥反應(yīng)，而PMSC則具有免疫調(diào)控的作用[10]。PMSC的增殖速度更快，而且更具長期生長的能力。另外，胎盤可以抑制細(xì)胞間相互刺激引起的T淋巴細(xì)胞增殖的現(xiàn)象，因此PMSC是臍帶血來源的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)的最佳滋養(yǎng)層細(xì)胞，對其有肯定的體外支持和擴(kuò)增作用，而且PMSC的造血支持作用優(yōu)于BMSC[15]。通過對近幾年國內(nèi)外有關(guān)于PMSC研究的文獻(xiàn)回顧，我們總結(jié)PMSC較其它來源成體干細(xì)胞有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）取材幾乎不受限制，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景；（2）PMSC具有發(fā)育上的原始性，較之其他組織類型來源的成體干細(xì)胞具有更好的自我更新和多向誘導(dǎo)分化能力；（3）不會給患者造成不必要的恐慌和繼發(fā)醫(yī)源性損害；（4）具有正常的染色體核型，致瘤實驗陰性，說明其遺傳性狀穩(wěn)定、安全。

五、臨床應(yīng)用及展望

人PMSC作為一種良好的“種子細(xì)胞”來源，它可以對受傷或病變的多種組織器官加以修復(fù)和重建。Ichim等[33]發(fā)現(xiàn)輸注入PMSC后可抑制心肌炎癥、抑制心肌細(xì)胞的凋亡、刺激血管增生，并可觀察到對擴(kuò)張性心肌病有一定的療效，這些研究對心衰的細(xì)胞學(xué)治療有巨大的貢獻(xiàn)[34]。人羊膜上皮細(xì)胞體外定向分化的肝細(xì)胞可以表達(dá)至少30種人成體肝臟所表達(dá)的基因，這說明人羊膜上皮細(xì)胞來源的肝細(xì)胞對肝臟疾病可進(jìn)行有效的治療[21]。將羊膜上皮細(xì)胞移植入脊髓損傷小鼠模型的受損部位后觀察到功能逐漸改善，用大鼠脊髓損傷評分系統(tǒng)評估小鼠后肢能力，最后達(dá)到19分，比正常動物的比分僅低2分[35]。Liu等[24]報道了PMSC具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用，并具有向創(chuàng)傷局部擴(kuò)充歸巢，向創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞——內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的作用；還可作為VEGF的載體細(xì)胞，運(yùn)載目的基因到達(dá)靶區(qū)域發(fā)揮VEGF的長效促愈功能。王博蔚等[36]通過研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因mdr1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有效轉(zhuǎn)染PMSC，轉(zhuǎn)染的外源基因不但可充分表達(dá)，也可發(fā)揮正常的生理功能。

綜上所述，PMSC既有和其他來源MSC相似的生物學(xué)特征，同時在某些生物學(xué)特性方面有著其他來源MSC不具備的優(yōu)勢，是一種極具開發(fā)和研究價值的“種子細(xì)胞”。

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