江軍 范平 李東良 陳仕祥 王夢炎 何維新 熊志遠

自體干細胞治療失代償肝硬化的療效觀察

江軍 范平 李東良 陳仕祥 王夢炎 何維新 熊志遠

目的 分析自體干細胞移植治療失代償肝硬化的臨床效果。方法回顧性分析2007年3月至2009年6月在解放軍第一一三醫(yī)院肝病科就診的62例失代償乙肝肝硬化患者，其中30例行自體干細胞移植，32例納入對照，分別在4、12、24、96周進行隨訪；兩組肝功指標(biāo)比較用獨立t檢驗，治療后不同時間各肝功指標(biāo)的比較用F檢驗及LSD兩兩檢驗，兩組之間肝癌發(fā)生率和死亡率比較應(yīng)用四格表c2檢驗。結(jié)果干細胞組治療前及治療后4、12、24、96周，其肝功指標(biāo)白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBiL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT)、膽堿酯酶（CHE）、凝血酶原時間（PT）和肝功能分級（CTP)值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 8.521、11.198、39.652、6.172、9.795，10.961，P均= 0.000）；對照組治療前及治療后4、12、24、96周，其肝功指標(biāo)ALB、TBiL、ALT值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，（F = 5.594、13.602、52.612，P均= 0.000），而CHE、PT和CTP值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 0.999、1.560、2.371，P = 0.410、0.188、0.055）。隨訪第96周，干細胞組和對照組的ALB（g/L）為35.08 ± 7.93、30.52 ± 5.45（t = 2.524，P = 0.018） ；TBIL（μmol/L）為32.12 ± 19.23、35.77 ± 17.58（t = 2.008，P = 0.050）；ALT（U/L）為34.12 ± 6.88、40.23 ± 7.12（t = 2.781,P = 0.007）；CHE(U/L)為3801.98 ± 2012.21、2702.12 ± 1722.70（t = 2.923，P = 0.008） ；PT(S)為14.50 ± 4.12、18.89 ± 4.99（t = 3.625，P = 0.000） ；CTP（分）為6.10 ± 2.01、9.32 ± 4.19（t = 3.939,P = 0.001）。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。干細胞組死亡率為6.67﹪，低于對照組的25.00﹪（c2= 3.847，P = 0.049），肝癌發(fā)生率兩組無統(tǒng)計學(xué)意義（c2= 0.286，P = 0.594）。結(jié)論自體干細胞移植能改善失代償肝硬化近期肝功能和降低死亡率，是一種較安全、有效的治療方法。

干細胞； 移植； 肝硬化

干細胞肝臟移植治療可促進肝臟再生，近年來備受關(guān)注。無論是骨髓干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）移植還是外周血干細胞（peripheral blood stem cell，PBSC）移植治療肝硬化的療效在動物實驗和臨床上均得到證實。本研究回顧分析干細胞治療失代償乙肝肝硬化患者的臨床療效及安全性。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2007年3月至2009年6月在解放軍第一一三醫(yī)院肝病科就診的62例失代償乙肝肝硬化患者，經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡31 ～ 70歲，血清白蛋白（albumin，ALB）20 ～ 29 g/L，總膽紅素（total bilirubin，TBiL）30 ～ 170 mmol/L，凝血酶原活動度（prothrombin activity，PTA）25﹪～ 30﹪，凝血酶原時間（prothrombin time，PT）18 ～ 24 s，大量腹水控制到中等以下，自發(fā)性腹膜炎及肝性腦病已治愈，肝功能分級（child-turcotte-push，CTP)評分≥7分，其中有19例患者曾行脾切除手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝臟或其他臟器的腫瘤、靜脈曲張破裂出血、自發(fā)性細菌性腹膜炎、肝性腦病、肝腎綜合征、急性感染發(fā)作期、門靜脈血栓以及嚴重的心功能不全。臨床診斷均符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》中乙型肝炎肝硬化臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。62例患者均接受內(nèi)科綜合治療，服用核苷類抗病毒藥。自體干細胞移植組（n = 30），其中16例采用BMSC，14例行PBSC移植；對照組（n = 32），不行干細胞移植，兩組臨床資料的基線特征相似，在96周時回顧分析其臨床療效及安全性。

二、方法

1. BMSC移植：局部麻醉下從骼骨處抽取自身骨髓血約100 ～ 140 ml，在實驗室將骨髓血離心、分離等處理后制備20 ml干細胞懸濁液備用。單次移植提取的單個核細胞總量為（0.8～ 2.6）×109個/ L，平均為1.5 × 109個/ L。

2. PBSC移植：患者用粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）按5 ～ 10 μg·kg-1·d-1，動員4 d，外周血白細胞數(shù)達到一定數(shù)量后，經(jīng)MCS+血細胞分離機分離和收集PBSC，循環(huán)血量約6000 ～ 7000 ml，PBSC計數(shù)為107～108個/ L。期間觀察有無低鈣性口周麻木、抽搐、低血容量性面色蒼白和暈厥等副反應(yīng)。

3.干細胞移植手術(shù)在DSA室中進行：經(jīng)股動脈插管至肝固有動脈，注射造影劑，觀察肝內(nèi)血管情況并排除占位病變后，將采集的單個核細胞配制成（1 ～ 9）×109/L，緩慢注入肝內(nèi)。穿刺點加壓包扎，術(shù)后行肝動脈插管術(shù)后常規(guī)護理，24 h插管側(cè)肢體呈伸直位并制動，預(yù)防性應(yīng)用抗生素1 d。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。6項肝功檢查結(jié)果均以±s表示，治療組與對照組各肝功指標(biāo)的比較用獨立t檢驗，治療后不同時間肝功指標(biāo)比較采用單因素F檢驗及LSD兩兩檢驗，兩組肝癌發(fā)生率和死亡率比較應(yīng)用四格表c2檢驗。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

統(tǒng)計學(xué)分析顯示：干細胞組治療前及治療后4、12、24、96周，其肝功指標(biāo)ALB、TBiL、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine amino transferase，ALT)、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和CTP值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 8.521、11.198、39.652、6.172、9.795、10.961，P均= 0.000，表1）；對照組治療前及治療后4、12、24、96周，其肝功指標(biāo)ALB、TBiL、ALT值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 5.594、13.602、52.612，P均= 0.000），而CHE、PT和CTP值，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 0.999、1.560、2.371，P = 0.410、0.188、0.055，表2）。

表1 62例失代償肝硬化患者行干細胞治療組各項肝功指標(biāo)檢查結(jié)果（±s）

表1 62例失代償肝硬化患者行干細胞治療組各項肝功指標(biāo)檢查結(jié)果（±s）

注：ALB：白蛋白；TBIL：總膽紅素；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；CHE：膽?酯酶；PT：凝血酶原時間；CTP：肝功能分級。a與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.394 ～ 3.392，P ＜ 0.05）

時間 例數(shù) ALB（g/L） TBIL（μmol/L） ALT（U/L） CHE（U/L） PT（s） CTP 0周 30 27.32 ± 3. 32 70.12 ± 34.34 101.23 ± 40.89 1998.57 ± 1059.54 20.12 ± 4.09 9.08 ± 1.21 4周 30 31.11 ± 5.23 50.32 ± 24.11 45.65 ± 13.89a 2267.31 ± 1945.31 18.06 ± 4.71 7.36 ± 1.78 12周 30 30.34 ± 3.90a 41.23 ± 18.23a 40.56 ± 14.21a 3412.32 ± 2171.19a 15.31 ± 4.01a 7.18 ± 2.50a24周 29 34.14 ± 7.21a 40.09 ± 17.34a 35.12 ± 29.20a 3721.21 ± 1856.21a 14.94 ± 3.98a 6.12 ± 2.24a96周 28 35.08 ± 7.93a 32.12 ± 19.23a 34.12 ± 6.88a 3801.98 ± 2012.21a 14.50 ± 4.12a 6.10 ± 2.01aF值 8.521 11.198 39.652 6.172 9.795 10.961 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 62例失代償肝硬化患者對照組各項肝功指標(biāo)檢查結(jié)果（±s）

表2 62例失代償肝硬化患者對照組各項肝功指標(biāo)檢查結(jié)果（±s）

注：ALB：白蛋白；TBIL：總膽紅素；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；CHE：膽?酯酶；PT：凝血酶原時間；CTP：肝功能分級。a與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.394 ～ 3.392，P ＜ 0.05）

時間 例數(shù) ALB（g/L） TBIL（μmol/ L） ALT（U/L） CHE（U/L） PT（s） CTP 0周 32 26.12 ± 2. 76 68.55 ± 12.34 121.77 ± 45.98 2012.90 ± 1254.90 19.88 ± 5.21 9.21 ± 1.89 4周 31 25.09 ± 3.63 48.21± 31.67 47.71 ± 15.35a2012.31 ± 1081.67 18.66 ± 3.21 8.78 ± 1.01 12周 31 27.78 ± 4.31 39.08 ± 16.98a 43.31 ± 17.80a 2310.32 ± 1909.35 17.55 ± 5.23 8.80 ± 2.79 24周 28 28.03 ± 6.29 38.88 ± 14.56a 38.34 ± 28.89a 2457.23 ± 1723.80 17.31 ± 4.12 10.70 ± 3.21 96周 24 30.52 ± 5.45a 35.77 ± 17.58a 40.23 ± 7.12a 2702.12 ± 1722.70a 18.89 ± 4.99 9.32 ± 4.19 F值 5.594 13.602 52.612 0.999 1.560 2.371 P值 0.000 0.000 0.000 0.410 0.188 0.055

表3 兩組失代償肝硬化患者第96周肝癌發(fā)生率及病死率的比較

表4 兩組失代償肝硬化患者第96周肝功結(jié)果比較（±s）

表4 兩組失代償肝硬化患者第96周肝功結(jié)果比較（±s）

注：ALB：白蛋白；TBIL：總膽紅素；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；CHE：膽堿酯酶；PT：凝血酶原時間；CTP：肝功能分級評分。

組別 例數(shù) ALB（g/L） TBIL（μmol/L） ALT（U/L） CHE（U/L） PT（s） CTP（分）干細胞組 28 35.08 ± 7.93 32.12 ± 19.23 34.12 ± 6.88 3801.98 ± 2012.21 14.50 ± 4.12 6.10 ± 2.01對照組 24 30.52 ± 5.45 35.77 ± 17.58 40.23 ± 7.12 2702.12 ± 1722.70 18.89 ± 4.99 9.32 ± 4.19 t 值 2.524 2.008 2.781 2.923 3.625 3.393 P 值 0.018 0.050 0.007 0.008 0.000 0.001

至96周干細胞組共死亡2例，1例死于上消化道出血，1例死于肝癌；對照組共死亡8例，3例死于肝功能衰竭，1例死于繼發(fā)感染，2例死于上消化道出血，2例死于肝癌。兩組死亡率分別為6.67﹪和25.00﹪(c2= 3.85，P ＜ 0.05)。干細胞組1例（3.33﹪）和對照組2例（6.25﹪）發(fā)生肝細胞癌（c2= 0.286，P ＞ 0.05,表3）。同時至96周時，干細胞組的6項肝功指標(biāo)均低于對照組（t = 2.008 ～ 3.625，P = 0.000 ～ 0.050,表4）。

討 論

近年來，干細胞移植治療肝臟疾病取得了很大進展[2-5]。國外學(xué)者[6-7]報道自體BMSC移植可促進受損肝臟的功能恢復(fù)和再生，能改善血清膽紅素、ALB、凝血國際標(biāo)準(zhǔn)化比值、生活質(zhì)量、Child-Pugh評分及MELD評分，治療后未見不良反應(yīng)[8-12]。Piscaglia等[13]研究結(jié)果顯示G-CSF可促進BMSC遷移到肝臟，同時增強內(nèi)源性肝臟肝細胞，即卵圓細胞的反應(yīng)修復(fù)肝臟。國內(nèi)韓英等[14]報道PBSC移植治療失代償期肝硬化20例，可以改善肝臟的合成功能。上述研究均提示自體干細胞移植治療肝臟疾病有效。

骨髓干細胞的獲得是通過骨髓穿刺，再經(jīng)離心、分離制備獲取干細胞，而外周血干細胞是通過粒細胞集落刺激因子的動員，經(jīng)血細胞分離機收集干細胞。理論上認為骨髓源性干細胞種類多，包括造血干細胞、間充質(zhì)干細胞及骨髓干細胞，細胞更加原始。而外周血干細胞通過粒細胞集落刺激因子的動員，在外周血獲取，細胞種類少，主要是造血干細胞。本研究進行的小鼠肝再生的實驗中，也證明粒細胞集落刺激因子能促進小鼠的肝再生。

本研究隨訪分析了96周自體干細胞移植治療失代償乙肝肝硬化的臨床治療作用，統(tǒng)計學(xué)分析顯示：治療組4周后，患者的酶學(xué)指標(biāo)ALT較治療前有明顯變化好轉(zhuǎn)，TBil從12周始較治療前有明顯好轉(zhuǎn)；肝臟的合成功能指標(biāo)（ALB和PT）、肝功能（ALB的增高和CTP評分的減少），從12周始較治療前有明顯改善。對照組治療后4周，患者的酶學(xué)指標(biāo)ALT較治療前也有明顯好轉(zhuǎn)，TBil從12周始較治療前也有明顯好轉(zhuǎn)；但肝臟的合成功能指標(biāo)及肝功能未見有明顯變化。隨訪至96周，干細胞組有些作用持續(xù)存在，共死亡2例，1例死于上消化道出血，1例死于肝癌。對照組共死亡8例，3例死于肝功能衰竭，1例死于繼發(fā)感染、2例死于上消化道出血，2例死于肝癌。兩組死亡率分別為6.67﹪和25.00﹪。干細胞組1例（3.33﹪）和對照組2例（6.25﹪）發(fā)生肝細胞癌。隨訪至96周，結(jié)果顯示干細胞組在CHE、PT及CTP評分的改善均優(yōu)于對照組；兩組肝臟酶學(xué)都有明顯好轉(zhuǎn)，考慮與內(nèi)科綜合保肝、降酶及服用核苷類抗病毒治療有關(guān)。死亡率干細胞組明顯低于對照組，肝細胞發(fā)生癌率兩組無差異。

自體干細胞移植可改善患者的肝功能，該結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)干細胞移植促進肝臟再生的結(jié)果相似。其機制可能是：肝動脈介入輸注細胞可使干細胞在肝臟局部產(chǎn)生高濃度的細胞群，有利于其在肝臟中定植并發(fā)揮作用[6-7]。動物試驗中發(fā)現(xiàn)從小鼠尾靜脈注入骨髓干細胞，2周后該小鼠肝組織病理片子中也可發(fā)現(xiàn)有些細胞形成類似肝細胞樣的細胞。自體干細胞移植治療失代償肝硬化的效果，目前還缺乏大樣本、隨機、對照的臨床研究證據(jù)的支持，從實驗及臨床的研究結(jié)果來看，應(yīng)當(dāng)是一種有效、安全的方法，對不同患者，應(yīng)該掌握合適的治療時機?？傊泽w干細胞移植治療失代償肝硬化能改善近期肝功能和降低死亡率，是一種安全、有效的治療方法。

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Efficacy of autologous stem cells for treatment of decompensated liver cirrhosis: A study of 96 weeks in 62 cases

JIANG Jun*, FAN Ping, LI Dong-liang, CHEN Shi-xiang, HE Xiuhua, XIONG Zhi-yuan,*Department of Infectious Diseases, The No.113 Hospital of People’s Liberation Army, Ningbo 315040, China

JIANG Jun, Email：Jiangjun2005@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the clinical efficiency of autologous stem cells (ASC) transfusion for decompensate liver cirrhosis (LC).MethodsA total of 62 chronic hepatitis B patients with decompensated LC, including 30 patients receiving ASC transfusion, and 32 patients receiving saline as the control, were recruited; clinical parameters were evaluated during the 96 weeks of follow-up; SPSS13.0 software was applied for analysis; parametric data were analyzed by t test; non-parametric data were carried out by c2 test between the two groups.ResultsAt weeks 4, 12, 24, 96, there were significant improvement in patients treated with ASC transfusion compared with pretherapy, for serum albumin levels (ALB), total bilirubin levels (TBiL), alanine aminotransferase(ALT), prothrombin time(PT), cholinesterase (CHE)andchild-Turcotte-Push (CTP)( F = 8.521、11.198、39.652、6.172、9.795、10.961, P = 0.000). In the control group, some parameters had significant improvement compared with pretherapy; ALB, TBIL and ALT(F = 5.594、13.602、52.612, P = 0.000), other parameters were similar to pretherapy(CHE)PT and CTP (F = 0.999、1.560、2.371，P = 0.410、0.188、0.055). At 96 week, ALB, TBIL, ALT, CHE, PT and CTP were （35.08 ± 7.93）g/L and （30.52 ± 5.45）g/L（t = 2.524，P = 0.018）, （32.12 ± 19.23）μmol/L and （35.77 ± 17.58）μmol/L（t = 2.008，P = 0.050）, （34.12 ± 6.88 ）U/L and （40.23 ± 7.12）U/L（t = 2.781, P = 0.007）, （3801.98 ± 2012.21）U/L and （2702.12 ± 1722.70） U/L（t = 2.923, P = 0.008） ,(14.50 ± 4.12) S and （18.89 ± 4.99 ）S（t = 3.625, P = 0.000）, (6.10 ± 2.01) min and (9.32 ± 4.19) min for the treatment and control group respectively（t = 3.939, P = 0.001）Mortality in patients treated with ASC transfusion was significant lower than controls(c2= 3.847, P = 0.049). No significant difference in the incidence of liver cancer were observed (c2= 0.286, P = 0.594). Conclusions ASC transfusion is clinically safe and could improve liver function and reduce the mortality in patients with decompensated LC. ASC transfusion, therefore, might be a novel therapeutic approach for patients with decompensated LC.

Stem cell； Transplantation, Autologous； Liver cirrhosis study

2012-08-15)

(本文編輯：陳媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.01.004

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新項目（10MA020），寧波市自然基金（2008A610096）

315040 寧波，解放軍第一一三醫(yī)院肝病科（江軍、范平、陳仕祥、王夢炎、何維新、熊志遠）；南京軍區(qū)福州總醫(yī)院肝膽內(nèi)科（李東良）

江軍，Email：Jiangjun2005@gmail.com

江軍, 范平, 李東良, 等. 自體干細胞治療失代償肝硬化的療效觀察[J/CD].中華細胞與干細胞雜志:電子版, 2013, 3(1): 13-17.