Kobayashi T 論著 路君 編譯

利用患者自身的多能干細胞、突破器官形成障礙、體外構建完整的器官是再生醫(yī)學研究領域的最終目標。隨著誘導多潛能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）技術的發(fā)展，人們已經(jīng)可以獲得患者的iPSC。雖然體細胞重編程還存在潛在分險，但真正的挑戰(zhàn)是建立一種器官形成的方法。體外實現(xiàn)器官再造相當復雜，囊胚互補技術是實現(xiàn)這一目標的方法之一。囊胚互補最早由Chen等報道，他們的研究證明Rag2-/-小鼠在囊胚期將野生型小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，mESC）注射到內細胞團，發(fā)育出表型正常的小鼠。Rag2基因敲除引起小鼠胚胎發(fā)育過程中T、B淋巴細胞系缺失，小鼠體內T、B淋巴細胞完全由野生型mESC發(fā)育而來。Nakauchi研究小組認為，可以在基因敲除而造成器官發(fā)育缺失的模型動物中復制這一現(xiàn)象，因此他們關注到胰腺及胰腺發(fā)育相關轉錄因子Pdx1。胰腺和十二脂腸同型盒基因（pancreatic and duodenal homeobox1，Pdx1）在胰腺發(fā)育和β細胞分化中發(fā)揮重要作用。Pdx1基因敲除小鼠出生后因胰腺缺失死亡。Nakauchi研究小組假設Pdx1-/-小鼠發(fā)育過程中因沒有胰腺器官而營造了一個“發(fā)育微環(huán)境”，注射多潛能干細胞（pluripotent stem cell，PSC）可形成完全由 PSC來源的、功能正常的胰腺。他們共設計了3組實驗證明這種囊胚互補性。

研究的第一個目標是在Pdx1基因敲除小鼠中獲得小鼠PSC（mPSC）來源的胰腺。用于注射囊胚的細胞有mESC和GT3.2小鼠iPSC。通過顯微注射將GT3.2miPSCs注入Pdx1-lacZ Knockin 小鼠（Pdx+/-）配對產(chǎn)生的子代囊胚中。結果顯示囊胚注射后出生的各基因型小鼠都有胰腺器官，其中也包括Pdx1-/-新生小鼠。Pdx+/-和Pdx+/+小鼠胰腺由自身細胞及外源EGFP-miPSC或mESC共同分化而來，與嵌合體動物身體其他各器官一致。嵌合的Pdx-/-小鼠胰腺形狀和組織學檢測均正常，胰腺細胞（外分泌、內分泌和導管上皮細胞）皆來源于EGFP-miPSC或mESC，但胰腺中的血管、神經(jīng)和成纖維細胞則由自體及外源細胞共同發(fā)育而來。Pdx1-/-嵌合小鼠可存活至成年，GTT實驗結果表明Pdx1-/-嵌合小鼠胰島素分泌在高血糖時增加，血糖和正常小鼠類似。STZ誘導C57BL/6小鼠發(fā)生糖尿病，從表達EGFP的miPSC來源胰腺中分離的胰島移植在糖尿病小鼠腎包膜下。2個月后依然可以在移植處檢測到表達EGFP的miPSC來源的胰島細胞。移植后的糖尿病小鼠血糖能夠恢復正常，葡萄糖耐量（glucose tolerance testing，GTT）實驗結果與正常小鼠相似。這部分研究結果表明，發(fā)育過程中某個器官缺失能營造出一個微環(huán)境（Pdx1-/-小鼠和胰腺缺失微環(huán)境）。PSC來源細胞可以代償?shù)恼紦?jù)這個微環(huán)境，形成一個幾乎由供方PSC發(fā)育而來的器官。

研究的第二個目標是得到小鼠和大鼠的種間嵌合體。將EGFP標記的GT3.2 miPSC注射到大鼠囊胚，或將EGFP標記的大鼠iPSC（riPSC）注射到小鼠囊胚，注射的小鼠或大鼠iPSC能夠參與異基因動物的胚胎發(fā)育并產(chǎn)生種間嵌合體動物。嵌合的PSC分布在全身各器官，且具有正常功能。種間嵌合動物中異基因來源細胞比例明顯低于種內嵌合，大鼠或小鼠嵌合體的檢測結果均一致。大鼠母親生育的嵌合體動物形態(tài)與新生大鼠相似，而由小鼠母親生育的則形態(tài)類似于正常的新生小鼠。異源細胞的貢獻率會影響嵌合動物體型。組織免疫染色的結果可見EGFP陽性細胞存在于多種組織和器官中，但異種細胞未參與種間嵌合體動物的生殖細胞分化。大鼠沒有膽囊，而小鼠有膽囊。當mPSC注入大鼠囊胚產(chǎn)生的種間嵌合體（與大鼠體型相似）沒有膽囊，相對的rPSC注入小鼠囊胚產(chǎn)生的嵌合體（體型與小鼠相似）有膽囊。

研究的第三個目標是，通過囊胚注射在Pdx1-/-小鼠體內產(chǎn)生異基因的大鼠胰腺。riPSC作為供方細胞，囊胚注射后139個胚胎種植在假孕小鼠子宮，34個小鼠出生。Pdx1-/-種間嵌合體胰腺幾乎都是EGFP陽性細胞。經(jīng)免疫組織熒光檢測發(fā)現(xiàn)表達EGFP的riPSC來源的胰腺細胞可共表達α-淀粉酶（外分泌標志基因）、胰島素、胰高血糖素和生長素（內分泌標志基因）。嵌合riPSC的Pdx1-/-小鼠能生長至成年（8周），胰腺中絕大部分細胞為EGFP陽性細胞。成年小鼠的GTT實驗中，可見葡萄糖升高引起胰島素分泌增加。這部分結果表明注射riPSC到Pdx1-/-小鼠胚胎成功的創(chuàng)造出擁有大鼠胰腺的嵌合小鼠，該技術被稱為“種間囊胚互補”。

有研究報道過類似的技術，如胸腺上皮發(fā)育、心臟缺損修復、卵巢造血細胞及生殖細胞的克隆研究，但是沒有研究曾證明外源細胞可形成完整的器官，彌補發(fā)育中的致死性缺陷，使嵌合體動物存活至成年。目前，體外將PSC分化為胰島素分泌細胞的方法主要是采用多步誘導的方式。然而體外誘導的方法還有待于改進，胰島素分泌量及葡萄糖響應方面仍需提高，且未分化的iPSC還有引起畸胎瘤的風險。本研究通過囊胚互補的方法在體內形成胰腺，模擬了近于正常的發(fā)育過程和表觀遺傳改變，逆轉錄病毒感染誘導的iPSC成瘤風險還需長期觀察。

本研究成功的在Pdx1-/-小鼠中獲得功能正常的大鼠胰腺。所有注射riPSC的Pdx1-/-小鼠囊胚出生后都有胰腺組織，盡管只有部分嵌合體動物能活到成年，成年動物riPSC來源的胰腺形態(tài)和組織學正常，未出現(xiàn)糖尿病癥狀，GTT結果表明胰腺功能良好。已往研究表現(xiàn)在異基因環(huán)境中可以形成有功能的細胞（精子、肝細胞），不過此前沒有在異基因環(huán)境中PSC形成器官并能夠拯救致死性突變至成年的報道。這種器官再造模式有望用于在豬或其他大型動物體內產(chǎn)生人的器官，但是要將此技術用于臨床還有許多的難題需要克服。本研究獲得了小鼠和大鼠的嵌合體動物，但這一過程中的胚胎致死率高、成年動物存活率低。豬或綿羊與人的胚胎發(fā)育存有很大差異，可能難以實現(xiàn)囊胚互補。另外一個問題就是PSC來源的細胞不僅存在于胰腺，還存在于包括腦和生殖腺的所有器官，尚沒有適合控制PSC分化的方法，因此這種在牲畜體內獲得人類器官的方式面臨嚴峻的倫理質疑。

綜上所述，該研究向人們描繪了一種實現(xiàn)再生醫(yī)學終極目標的可能途徑。