胡平

（南京醫(yī)科大學附屬南京婦幼保健院，江蘇 南京 210004）

1 原文摘要

The purpose of this study was to determine the deep sequencing and analytic conditions needed to detect fetal subchromosome abnormalities across the genome from a maternal blood sample.Cellfree（cf）DNA was isolated from the plasma of 11 pregnant women carrying fetuses with subchromosomal duplications and deletions，translocations， mosaicism， and trisomy 20 diagnosed by metaphase karyotype.Massively parallel sequencing（MPS）was performed with 25-mer tags at approximately 109tags per sample and mapped to reference human genome assembly hg19.Tags were counted and normalized to fixed genome bin sizes of 1Mb or 100 kb to detect statistically distinct copy-number changes compared to the reference.All seven cases of microdeletions，duplications，translocations，and the trisomy 20 were detected blindly by MPS，including a microdeletion as small as 300 kb.In two of these cases in which the metaphase karyotype showed additional material of unknown origin，MPS identified both the translocation breakpoint and the chromosomal origin of the additional material.In the four mosaic cases，the subchromosomal abnormality was not demonstrated by MPS.This work shows that in nonmosaic cases，it is possible to obtain a fetalmolecular karyotype by MPS ofmaternal plasma cfDNA that is equivalent to a chromosome microarray and in some cases is better than a metaphase karyotype.This approach combines the advantage of enhanced fetal genomic resolution with the improved safety of a noninvasive maternal blood test.

2 論文核心內(nèi)容及點評

該文章于2013年2月發(fā)表于《The American Journal of Human Genetics》雜志。在該研究中，作者主要評估了采用孕母血漿高通量測序進行胎兒全基因組范圍內(nèi)染色體微缺失／微重復無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的技術(shù)條件及其檢測效果。主要內(nèi)容如下：

已有的研究表明，與常規(guī)G顯帶技術(shù)相比，染色體微陣列芯片技術(shù)（chromosome microarrays，CMA）用于產(chǎn)前診斷可以顯著提高染色體異常檢出率，尤其是G顯帶無法檢出的微缺失／微重復。因此CMA具有著良好的臨床應用價值，在一些國家已被推薦成為一線檢測技術(shù)。但是該技術(shù)仍需要通過侵入性的手段進行胎兒細胞取材，必須配備臨床取材經(jīng)驗豐富的婦產(chǎn)科醫(yī)生，并可能導致胎兒流產(chǎn)。那么，是否有一種技術(shù)可以實現(xiàn)非侵入性的胎兒染色體微缺失／微重復無創(chuàng)傷檢測呢？

通過母體血漿游離DNA高通量測序檢測胎兒常見染色體非整倍體異常（21、13、18）已有大量的研究報道，并逐漸成為臨床上一種替代侵入性檢查的新型方案。這種方法是否可能實現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)的染色體亞顯微異常檢測呢？作者認為，這種方法理論上是可行的。事實上，關(guān)于微缺失／微重復的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測研究已有5例成功的病例報道。第一篇研究報道通過母體血漿游離DNA高通量測序在一位35孕周孕婦血漿中成功檢測出1例4.2 Mb大小的12p11.22-12.1微缺失；另一個研究小組的報道采用該技術(shù)檢測出了2例22q11.2微缺失；在該作者前期研究中也報道了1例11q21-23微缺失和6q重復的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。

該研究內(nèi)容分為2部分。第一部分是方法學驗證，血漿DNA的測序深度和胎兒DNA濃度對于胎兒染色體無創(chuàng)性檢測效果具有重要意義，作者為了確定所選擇的測序深度是否可以檢出全基因組范圍內(nèi)的微缺失／微重復及孕婦血漿中胎兒DNA相對濃度，采用了“人為摻入”策略模擬出胎兒染色體異常的孕婦血漿DNA樣本。將確診的染色體異常男性患兒及其母親基因組DNA打斷為200 bp大小的短片段，以模擬血漿中的游離DNA長度，并制備成患兒DNA／總DNA＝5%和10%兩種濃度混合DNA樣本共4組，進行了高通量測序測試。測序采用的是36bp的單向測序，獲得的reads數(shù)目（400～750）*106，4例標本包括21三體、7號染色體部分缺失、22號染色體部分重復、嵌合型15號染色體部分重復各一例，這4例檢測結(jié)果均與arrayCGH結(jié)果一致，且所測得的胎兒DNA相對濃度與實際摻入濃度基本一致。

第二部分是陽性孕婦血漿樣本的雙盲實驗。作者選取懷有染色體異常胎兒的孕婦血漿11例，采用的是25 bp的單向測序，每個標本獲得的reads數(shù)目（0.6～1.3）*109。標本中包括1例20號染色體三體，染色體缺失5例、重復4例，涉及到3、6、7、8、10、15、17、X號染色體，包括嵌合體標本4例，其中亞顯微缺失／重復4例。檢測結(jié)果：7例標本被成功檢出，所檢出的最小CNV為300 kb；2例含有不明染色體來源的標本被準確檢出；1例嵌合型微缺失檢出，3例嵌合型微缺失無法檢出。

本研究結(jié)果的幾個方面具有重要的價值：①該技術(shù)可以檢出除嵌合型之外的全基因組范圍染色體微缺失／微重復異常，檢測效果與胎兒細胞DNA的微陣列比較基因組雜交效果接近；②25 bp測序長度和109的測序深度條件已經(jīng)可以達到100 kb的檢測分辨率，顯著高于常規(guī)侵入性染色體G顯帶檢查，加大測序深度可繼續(xù)提高檢測分辨率；③當前條件下，25 bp和109檢測成本低于1000美元，但將來隨著測序成本降低會達到微陣列比較基因組雜交接近的價格；④另外，作者認為該技術(shù)也可用于其他混合DNA樣本的檢測，如癌癥患者血漿游離DNA中的CNV檢測。