張勝利 朱寶生

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南省第一人民醫(yī)院 遺傳診斷中心，云南 昆明 650032）

出生缺陷是影響出生人口素質(zhì)的重要問題，其會給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)，而中國又是出生缺陷高發(fā)國家，降低出生缺陷人口的出生率尤為重要。隨著全國出生缺陷監(jiān)測能力的提高，以醫(yī)院為基礎(chǔ)的出生缺陷監(jiān)測數(shù)據(jù)由1996年的87.7萬上升到2010年的149.9萬，增長幅度達70.9%［1］。產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的重要措施，傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法如絨毛活檢取樣、羊膜腔穿刺、臍血穿刺等均為介入性操作，這些操作的潛在風(fēng)險，如流產(chǎn)、感染、致畸等，給孕婦和家人帶來一定的精神壓力，且由于其創(chuàng)傷性的存在也使得產(chǎn)前診斷只在有限的人群范圍內(nèi)進行，這些風(fēng)險的存在也帶來一定的醫(yī)療隱患。非侵入性的產(chǎn)前檢查方法，如血液或超聲檢查的檢測范圍局限，不能作為診斷去解決病人存在的問題。而母血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)，極大促進了非侵入性產(chǎn)前診斷的研究，成為近年產(chǎn)前診斷研究的熱點。本文對胎兒游離DNA在非侵入性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用作一綜述。

1 孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)、來源、特征及清除機制

1.1 孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn) 1969年Walknowska等人發(fā)現(xiàn)孕男胎的婦女外周血中含有46，XY細胞，證實了孕婦外周血中確實存在胎兒細胞，但由于檢測成本高、技術(shù)繁瑣，而且母外周血中的胎兒細胞數(shù)量極少，限制了大規(guī)模臨床應(yīng)用。1996年Chen等首次在肺癌患者血漿和血清中檢測到腫瘤特異性DNA序列。由于胎兒和腫瘤在生物學(xué)上存在著相似性，受此啟發(fā)，1997年，Lo等［2］在孕男胎孕婦外周血漿及血清提取的DNA中擴增出Y染色體特異性序列，首次證明妊娠婦女外周血的血漿及血清中存在著穩(wěn)定的游離胎兒DNA（cell-free fetalDNA，cffDNA），在孕早期和孕晚期分別占血漿總DNA的3.4%和6.2%［3］，其他實驗室也有研究報道cffDNA大約占總游離DNA的10%～20%［4］。

1.2 孕婦血漿中cffDNA的來源 目前認為孕婦外周血中cffDNA的來源有以下幾種可能的機制：①胎盤滋養(yǎng)層細胞源性學(xué)說［5］，該觀點認為，胎兒DNA來源于滋養(yǎng)層細胞，孕4周時滋養(yǎng)層間隙被母血充盈，合體滋養(yǎng)層細胞可直接滲透入母血，激活母體免疫系統(tǒng)，破壞胎盤滋養(yǎng)層細胞，導(dǎo)致胎兒DNA直接進入母血循環(huán)，此時胎盤形成，但胎盤循環(huán)未建立，cff DNA的出現(xiàn)證明胎盤滋養(yǎng)層細胞是母血漿中胎兒DNA的最初來源，在母體血漿中檢測出了胎盤特異mRNA及胎盤來源的母胎差異性甲基化［6］（cff DNA更加證明了此學(xué)說）。②胎兒有核細胞破壞凋亡學(xué)說，該說認為cff DNA來源于進入孕婦外周血中的胎兒有核細胞的破壞和凋亡，胎兒細胞通過胎盤進入到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，cff DNA殘留下來。研究證實，在孕婦血漿中，存在胎兒有核紅細胞的凋亡，且有證據(jù)表明，cff DNA具有凋亡DNA片段的一些特征。③胎盤通道學(xué)說，該學(xué)說認為，在胎兒發(fā)育過程中，胎兒細胞凋亡后釋放出的DNA通過胎盤運輸?shù)皆袐D外周血中。Sekizawa等［7］研究發(fā)現(xiàn)母胎界面為雙向性通道，母胎之間的游離DNA（cell-free，cf DNA）可以通過胎盤轉(zhuǎn)運。④還有學(xué)說認為，孕婦血漿中cff DNA來自于不同胎兒組織的DNA釋放入羊水中，再通過胎盤和羊膜腔的直接彌散作用進入母血中［8］。目前關(guān)于cff DNA的來源尚沒有肯定的解釋，以上幾種學(xué)說都有其證據(jù)存在，所以其來源有待深層次研究。

1.3 孕婦血漿cff DNA的特征 研究表明cff DNA具有細胞凋亡的生化特性，即基因組DNA的片斷化。研究表明［9］孕婦血漿中cf DNA 分子大于201bp的占57%，胎源性cf DNA分子中80%片段長度在193bp以下，大于303bp的為0。新近研究報道［10］胎源性cf DNA的平均最大片段長度為286bp，并推論其是由≤2個核小體組成。目前對此現(xiàn)象尚無確切解釋，但此類發(fā)現(xiàn)使cff DNA分離和檢測更進一步，在進行無創(chuàng)性產(chǎn)前分子基因診斷中也有重要意義。

1.4 孕婦血漿cff DNA的清除機制 母血中cff DNA半衰期為16.3（4～30）分鐘，在產(chǎn)后2小時后絕大多數(shù)產(chǎn)婦檢測不到循環(huán)的胎兒cff DNA。因此，以母血中cff DNA為產(chǎn)前基因診斷研究的對象可以避免前次妊娠殘留有胎兒DNA而影響本次妊娠的分析結(jié)果。Illanes等［11］的數(shù)據(jù)表明腎臟在血漿DNA清除中起主要作用，而這一結(jié)果也使其發(fā)現(xiàn)了尿中存在游離胎兒DNA的事實，為無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷提供了新的選擇。此外，母體血液中的血漿核酸酶、肝臟、腎臟對游離DNA也具有一定的清除作用。

2 血漿中胎兒DNA的檢測

2.1 生物學(xué)標(biāo)記物的發(fā)展 最早，通過男胎父源性的Y染色體特異序列的檢測作為cff DNA存在的標(biāo)記物，這就使得對孕婦外周血胎源DNA的應(yīng)用局限在檢測的胎兒遺傳物質(zhì)必須能與母親遺傳物質(zhì)顯著區(qū)分開來，即胎兒從父方繼承來的基因或突變，這種限制使得對cffDNA存在的檢測及從母親遺傳的等位基因的檢測陷入困境，因而大大限制了cff DNA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。

有研究者［12］根據(jù)母胎游離DNA分子大小的差異，通過電泳法和過柱法分離和富集cff DNA，并與其他技術(shù)結(jié)合用于后續(xù)檢測。這一技術(shù)方案已被認為是相對可靠的，但分離純化過程中可能存在樣本的污染。還有研究集中在短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）多態(tài)性上。鄧志輝等［13］通過擴增片段長度較小多態(tài)性豐富的MiniSTR等位基因座，檢測胎兒cff DNA，結(jié)果在9例孕婦血漿樣本中檢測到父源性STR等位基因。Dhallan等［14］建立了通過單核苷酸多態(tài)性（SNPs）區(qū)分胎兒DNA和孕母DNA并診斷胎兒染色體的數(shù)目的方法。在SNP的基礎(chǔ)上采用單等位基因堿基延伸反應(yīng)用于非侵入性產(chǎn)前診斷也有研究［15］。這些方法已取得一些進展但仍有其局限性，由于方法較復(fù)雜且受到基因多態(tài)性的影響，尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

在表觀遺傳學(xué)方面也有突破，自Chim等研究證實，maspin基因在胎盤細胞中處于低甲基化狀態(tài)，而在母血細胞中處于高甲基化狀態(tài)后，Chan等［16］也發(fā)現(xiàn)了位于3號染色體的RASSF1A基因在母血細胞和胎盤間有著不同的甲基化形式。利用母胎cf DNA甲基化的差異，既可以突破母血漿中檢測cffDNA的局限性，也可進行其他疾病的檢測。Papageorgiou等［17］利用21號染色體上的母胎基因甲基化程度的差異，分析母胎21號染色體比例來檢測21三體胎兒。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用DNA甲基化差異進行非侵入性產(chǎn)前診斷的方法得到不斷應(yīng)用［18］。

2.2 相關(guān)檢測技術(shù)的進步 由于孕婦血中胎兒游離DNA絕對量極其微少，需要采用非常敏感的方法才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果，而PCR技術(shù)的發(fā)展使微量的胎兒DNA的檢測成為可能。但由于傳統(tǒng)的PCR實驗方法的局限性不能滿足臨床的需求，所以新的檢測技術(shù)方法不斷被應(yīng)用。

2.2.1 肽核酸 肽核酸（peptide-nucleic acid，PNA）是一類新的信息分子，其以比普通核酸更高的親和力及特異性與DNA或RNA雜交，形成具有高度熱穩(wěn)定性的復(fù)合體，來封閉母源性野生型模板，而另一組檢測突變的DNA引物參與父源性突變位點序列的PCR擴增。

2.2.2 飛行時間質(zhì)譜技術(shù) 由于母源性和胎源性的游離DNA的長度分布差異，應(yīng)用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，2種來源的DNA電離狀態(tài)的存在差異，在電場作用下分子通過飛行管道到達檢測器的飛行時間不同，進而區(qū)分2種來源的DNA。

近年來發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解析電力飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是一種新型的質(zhì)譜技術(shù)，其特點是在基質(zhì)中軟電離不會把分子打碎，可以檢測混合物，靈敏度高，其檢測效果類似于父源性等位基因得到了“提純”或富集，產(chǎn)生的檢測圖譜非常清晰。該技術(shù)已成為目前國際上母體血漿胎兒核酸突變分析的重要技術(shù)。但是其存在成本高、耗時長、步驟繁瑣、實驗條件要求高等問題。

2.2.3 實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（QPCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析。該技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)在非侵入性產(chǎn)前診斷中有較廣應(yīng)用。

2.2.4 數(shù)字化PCR 數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）是將樣本處理至單目標(biāo)分子后，同時獨立行PCR反應(yīng)，從而對樣本進行絕對定量檢測。后經(jīng)過不斷改良，發(fā)展出了BEAMing技術(shù)和微液數(shù)字PCR技術(shù)，檢測反應(yīng)更多更全，極大推進了該技術(shù)的臨床應(yīng)用可行性。Lun等［19］對實時熒光PCR、質(zhì)譜、微液數(shù)字PCR這3項技術(shù)進行了對比分析后，證實微液數(shù)字PCR技術(shù)具有最佳的穩(wěn)定性和定量準(zhǔn)確性。微液數(shù)字PCR技術(shù)無論在定性還是定量檢測方面都具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異等諸多優(yōu)點，是一項十分適用于母血中胎兒游離DNA檢測的技術(shù)。雖然目前其操作成本較高，但是相信隨著技術(shù)領(lǐng)域的不斷突破，微液數(shù)字PCR有望成為分子診斷實驗室的常規(guī)技術(shù)［20］。

2.2.5 大規(guī)模平行基因組測序 該技術(shù)對全基因組進行分析，不依賴于單個位點，能同時進行上億個測序反應(yīng)。對孕婦血漿中cf DNA進行測序，得到的堿基序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，通過生物信息統(tǒng)計分析來檢測疾病。

在非侵入性產(chǎn)前診斷的過程中，以上各種生物學(xué)標(biāo)記物及檢測技術(shù)的相互結(jié)合，相互促進，使非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷進步與完善。

3 孕婦血漿中胎兒游離DNA的臨床應(yīng)用研究

母血中cff DNA的在產(chǎn)前診斷方面的應(yīng)用主要分為兩方面，包括對胎兒DNA質(zhì)的檢測和胎兒DNA量的測定。質(zhì)的檢測是通過檢測胎兒DNA某些致病基因的存在或?qū)δ承┬匀旧w連鎖疾病或者其他疾病進行產(chǎn)前診斷。而有些疾病可以引起游離胎兒DNA量的異常，對胎兒游離DNA量的檢測可以及早發(fā)現(xiàn)疾病的存在，及早進行控制和治療。目前，游離胎兒DNA已經(jīng)用于性別鑒定及性染色體連鎖疾病、胎兒Rh系統(tǒng)基因型的檢測、妊娠相關(guān)疾病、胎兒染色體病、胎兒染色體片段異常、父系單基因遺傳病等的產(chǎn)前診斷研究中。

3.1 性別鑒定及X連鎖遺傳病 目前X連鎖遺傳病有200多種，常見的有肌營養(yǎng)不良、血友病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生等，對此類疾病，性別鑒定有著重要的優(yōu)生優(yōu)育意義。既往臨床早期產(chǎn)前性別診斷存在流產(chǎn)和致畸風(fēng)險，不易被孕婦接受，而母血中胎兒DNA在性別遺傳鑒定方面的研究開展較早、準(zhǔn)確也有其優(yōu)勢所在。Mohamad等［21］用mini-STR和熒光定量PCR兩種方法，在早孕期分別檢測母血漿胎兒游離DNA的Y染色體的特異性序列，結(jié)果顯示兩種方法的敏感性和特異性分別為95.9% 、98%和91.8% 、100%。近期，一項綜合分析了90個研究中心的10 587名胎兒性別鑒定的結(jié)果顯示［22］，用母血漿胎兒游離DNA結(jié)合多種實驗技術(shù)對胎兒性別鑒定的平均敏感性為96.6%，特異性為98.9%。利用胎兒游離DNA進行性別鑒定其準(zhǔn)確性已經(jīng)得到極大驗證，這樣只需對孕男胎的婦女行進一步的創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷即可，避免了對孕女胎婦女行創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷而導(dǎo)致的不必要的流產(chǎn)致畸風(fēng)險。雖然這些研究的準(zhǔn)確性已較滿意，但是對于仍可能存在的假陰性及假陽性的情況，研究者有采用STR的方法檢測X染色體上的位點來進一步診斷女性胎兒，還有采用檢測常染色體上的通用標(biāo)記物來作為陽性對照，確定胎源性物質(zhì)的存在［23］。無創(chuàng)產(chǎn)前性別鑒定對X連鎖遺傳病的診斷有較高的臨床價值，其高準(zhǔn)確性可降低侵入性產(chǎn)前診斷的使用率，進而減少流產(chǎn)和畸形的發(fā)生。

3.2 胎兒Rh系統(tǒng)基因型 RhD陰性的孕婦如有RhD陽性胎兒孕產(chǎn)史，則以后生育均可能引起胎兒紅細胞的破壞進而出現(xiàn)嚴重的貧血，還可引起新生兒溶血、心力衰竭、核黃疸甚至死亡。雖然Rh D陰性的發(fā)生率在不同人種中有所不同，但對于Rh D陰性的孕婦進行胎兒產(chǎn)前的Rh D血型檢測仍是非常有必要的。這項檢測可使孕Rh D陰性胎兒免于進行不必要的主動免疫治療，而使孕Rh D陽性胎兒能夠及早地選擇主動免疫治療或終止妊娠，為其臨床推廣應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷存在母胎出血、刺激抗體產(chǎn)生的風(fēng)險，所以非侵入性產(chǎn)前診斷就更凸顯出它的優(yōu)勢。Brojer等［24］對230例Rh D陰性的孕婦進行研究，擴增Rh D基因的第4內(nèi)含子、第7和第10外顯子，準(zhǔn)確率達99%。自2001年起，國際血型參比實驗室英國國家血液中心將利用孕婦血漿游離DNA進行胎兒RhD的基因分型作為常規(guī)檢查項目，這是首個臨床開展的以DNA為基礎(chǔ)的非侵入性產(chǎn)前診斷常規(guī)項目，此后，法國和荷蘭也將此列入常規(guī)項目。而Rh系統(tǒng)的c、E、K基因型的檢測也通過此方法得到應(yīng)用。Scheffer等［25］用熒光定量PCR技術(shù)，共對362名有檢測指征的孕婦進行Rh系統(tǒng)基因型的檢測（RhD168例、Rhc49例、RhE85例、Rh K 60例），其中351例（97%）得到檢測結(jié)果，且該部分無假陰性及假陽性結(jié)果存在，另11例由于胎兒游離DNA含量低及其他原因?qū)е聼o檢測結(jié)果。采用非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)對胎兒Rh系統(tǒng)基因型進行預(yù)測有較高的敏感性及特異性，可作為應(yīng)用于臨床的診斷技術(shù)。

3.3 妊娠相關(guān)疾病 研究發(fā)現(xiàn)很多妊娠相關(guān)疾病存在胎兒游離DNA濃度的異常升高［26］，例如早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限、羊水過多、侵入性胎盤、胎死宮內(nèi)、妊娠劇吐等，研究最多的是先兆子癇的異常變化，其可能的病理原因，一方面由于子癇前期胎盤通透性增加，可導(dǎo)致母血中cff DNA增多；另一方面，在高血壓等病理情況下，母體的肝、腎對cff DNA的清除減少［27］，致使cff DNA 的濃度升高。Cotter等［28］對88個病例和176個正常對照研究，發(fā)現(xiàn)早期母血中游離胎兒DNA增加的孕婦將更易發(fā)展為先兆子癇，游離胎兒DNA的量和先兆子癇的發(fā)病風(fēng)險之間存在一種劑量關(guān)系。另由Levine等［29］研究的較大樣本量的結(jié)果顯示，在120例發(fā)展為先兆子癇的病人和120例正常人群對照中，在相同孕周條件下，前者的cff DNA量為后者的2～5倍。InIllanes S等［30］在患有妊娠期高血壓病的孕婦外周血中檢測到cff DNA顯著升高，而在子癇發(fā)作之前其水平則有異常升高的情況。因此測定cff DNA的濃度可能對先兆子癇的篩查具有一定意義。但也有研究結(jié)果認為中孕期cffDNA的濃度不能預(yù)測不良妊娠結(jié)局［31］。該研究收納了611名孕婦，對其檢測發(fā)現(xiàn)，有不良妊娠結(jié)局的病例不能與cff DNA的濃度建立對應(yīng)關(guān)系。由于對cff DNA的濃度預(yù)測價值存在爭論，所以只有經(jīng)過大樣本多中心的研究，才能對cff DNA濃度的真正預(yù)測價值進行有效評估。

3.4 胎兒非整倍體染色體病 通常由于異常的減數(shù)分裂，使細胞內(nèi)同源染色體數(shù)目發(fā)生改變，產(chǎn)生非整倍體胎兒。部分非整倍體胎兒會發(fā)生自然流產(chǎn)，而有一部分則可存活出生，但幾乎都存在出生缺陷，最常見的是21三體綜合征。早期研究發(fā)現(xiàn)孕有21三體綜合征胎兒的孕婦血漿中胎兒游離DNA量比正常組高。近年來，由于胎兒標(biāo)記物和檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和相互結(jié)合應(yīng)用，胎兒非整倍體染色體病的診斷不斷進步。2010年，Tong等［32］應(yīng)用母胎差異性甲基化及dPCR技術(shù)相結(jié)合的新方法檢測21-三體，成功檢測5例21-三體產(chǎn)婦的血漿樣本，另外24個整倍體的孕婦血漿的分析，出現(xiàn)一個假陽性，可見表觀遺傳的染色體劑量方法也是非侵入性產(chǎn)前診斷的一種新方法。而在大規(guī)模并行基因組測序技術(shù)的推動下，母血漿cff DNA應(yīng)用于常見非整倍體的診斷研究，取得了更大發(fā)展。Fan等［33］首次對18例樣本進行高通量測序分析，準(zhǔn)確檢測出9例21三體、2例18三體、1例13三體和6例染色體整倍體。Bianchi等［34］通過對532例唐氏高危樣本進行測序檢測其唐氏綜合征的靈敏度為100%，假陽性率為0，性別檢測的靈敏度大于99%。而Jiang等［35］對903名孕婦的研究顯示，在該研究組中16例21三體胎兒、12例18三體胎兒、2例13三體胎兒全部檢測診斷正確，但存在1例18三體的假陽性，其對常染色體三體的檢測敏感性為100%，特異性為99.9%；在7例性染色體異常的病例中發(fā)現(xiàn)1例假陰性存在，其對性染色體三體的檢測敏感性為85.7%，特異性為99.9%。由于雙胎及多胎的母血中的濃度及胎兒遺傳物質(zhì)的區(qū)分等困難，使雙（多）胎的研究較少。有研究［36］檢測4例雙胎樣本，其中1例為47，XY，＋21核型的同卵雙胎；另1例為異卵雙胎，2個胎兒之一為1三體，另一胎兒核型正常；剩余2例雙胎核型正常。Canick等［37］對25例雙胎進行檢測，其中17例整倍體，5例同卵T21、2例異卵T21、1例異卵T13均得到準(zhǔn)確檢測；另外2例三胎正常病例也的到準(zhǔn)確預(yù)測。雖然目前在雙（多）胎病例研究中有較好的檢出率和極低的假陽性率，但由于雙（多）胎病例的復(fù)雜性，仍需要有更多的病例進行驗證。

該技術(shù)對單胎的常見常染色體數(shù)目異常疾病診斷的技術(shù)較成熟，但對雙胎及其他染色體異常包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常都需要大量的樣本的研究和技術(shù)的提高。在大規(guī)模推廣應(yīng)用之前需要有更多的檢測支持及經(jīng)濟性、實用性、合理性的分析，以減少不恰當(dāng)應(yīng)用帶來的不必要損失［38］。

3.5 胎兒染色體片段異常 鑒于利用胎兒游離DNA采用基因組測序的方法診斷21、13、18及性染色體數(shù)目異常的技術(shù)的發(fā)展和延伸，研究者同樣應(yīng)用測序技術(shù)來診斷胎兒染色體片段異常，并取得較好驗證結(jié)果。Peters等［39］對確診的1例父源性12p11.22～12p12.1缺失的胎兒進行無創(chuàng)診斷實驗，在其母妊娠35周時提取母血漿游離DNA，用7例染色體正常的標(biāo)本進行對照，并對12號和14號染色體進行測序檢測和數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，病例胎兒在12號染色體上存在約4Mb長度的微缺失，與對照組的結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Taylor等［40］近期又對2例中孕期22q11.2微缺失的胎兒進行測序檢測，同樣成功檢測到2例胎兒的微缺失存在，對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。雖然在胎兒染色體片段異常的診斷方面有一定的進展，但仍然存在技術(shù)的局限性，例如增加的數(shù)據(jù)處理需要、全基因組測序覆蓋的范圍等。另外，臨床的大規(guī)模應(yīng)用還需更多的樣本和臨床驗證。

3.6 胎兒單基因疾病 目前單基因病在新生兒中的發(fā)病率達3‰左右，介入性產(chǎn)前診斷仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，目前可以用cff DNA成功檢測的單基因病有軟骨發(fā)育不全、囊性纖維化病、地中海貧血、亨廷頓病、強直性肌營養(yǎng)不良、先天性腎上腺增生等。由于缺乏有效區(qū)分母體血漿中高母源性DNA和低胎源性游離DNA的手段，以及母源性基因突變或父母為相同基因突變時無法診斷胎兒基因型等。目前利用cff DNA檢測遺傳病只能檢測父源性單基因遺傳病，且許多遺傳病為突變所致，母胎DNA序列差異很小，所以兩者的鑒別要求實驗有較高的特異性敏感性，而要達到精確的鑒別在技術(shù)上比較困難，需要更精密的分析儀器和有效的試驗方法相結(jié)合。Ding等［15］選擇12例胎兒可能遺傳β-地中海貧血的孕婦胎兒，采用單個等位基因堿基延伸反應(yīng)對孕婦血漿中父源性的胎兒等位基因進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測，成功預(yù)測到胎兒的基因型。近期，Papasavva等［41］選擇了49個β球蛋白基因上的高雜合SNP位點，對101例可能遺傳父源性突變的β-地中海貧血胎兒進行檢測，結(jié)果顯示應(yīng)用此方法對診斷該疾病有較好的敏感性和特異性，為β-地中海貧血的非侵入性產(chǎn)前診斷提供了藍本。利用大規(guī)模并行基因組測序技術(shù)，Lo等［42］利用孕婦血漿中DNA進行全基因組測序，獲得了完整的胎兒及孕婦的基因組序列，構(gòu)建了全基因組遺傳圖譜，為直接利用胎兒游離DNA進行無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷開辟了新天地。

也有研究對母源性突變位點進行的探索，F(xiàn)iona等［43］對5例母胎基因型不同的標(biāo)本進行檢測，利用數(shù)字化核酸片段長度的方法來篩選母胎DNA，結(jié)合數(shù)字化突變位點進行相對定量技術(shù)，對PCR擴增的產(chǎn)物定量分析，統(tǒng)計分析孕婦血漿中野生型和突變性的比例，來預(yù)測胎兒的基因型。該檢測中有3例與預(yù)期結(jié)果相符，雖然該檢測的標(biāo)本例數(shù)較少，準(zhǔn)確性不是很高，但對母源性突變的檢測推進具有重要意義。Lun FMF等［44］也采用該方法對母親為雜合突變的血紅蛋白β鏈上的突變進行檢測，結(jié)果顯示利用數(shù)字化相對突變劑量和數(shù)字化核酸片段長度相結(jié)合的方法可增加胎兒基因型檢測率，能讓非侵入性產(chǎn)前診斷單基因病走的更遠。

4 目前利用孕婦血漿中胎兒DNA行產(chǎn)前診斷的一些問題

孕婦血漿中胎兒游離DNA的研究推動了非侵入性產(chǎn)前診斷遺傳病和妊娠相關(guān)疾病的預(yù)測的發(fā)展。但是，我們在對胎兒游離DNA認識和應(yīng)用方面還存在一些問題：①缺乏簡單、有效的胎兒標(biāo)記來證明提取的血漿DNA中有胎兒DNA的存在；②胎兒游離DNA的結(jié)構(gòu)、來源及清除機制還沒有完全搞清楚；③母血循環(huán)中胎兒DNA是否有轉(zhuǎn)錄活性；④母血中胎兒游離DNA的拷貝數(shù)低，及其富集技術(shù)的局限；⑤PCR的假陰性、假陽性問題，大部分染色體病不能有效診斷；⑥雙胎或多胎的復(fù)雜性也是一個不可忽視的問題；⑦母源性突變的檢測、雙親攜帶相同突變的胎兒基因分型、單基因疾病的檢測的局限性，尚無一種理想、可行的cff DNA基因突變檢測方法。這些問題都將是今后研究的方向。

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