任華景 劉素霞 張 斌

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北石家莊050015)

重組人血白蛋白的純化研究

任華景 劉素霞 張 斌

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北石家莊050015)

本文綜述了血漿人血清白蛋白(pHSA)和基因重組人血清白蛋白(rHSA)的優(yōu)缺點以及共同之處，講述了一種純化重組人血白蛋白的方法，為獲得高純度、安全、穩(wěn)定的產(chǎn)品，各種色譜分離技術(shù)得到更多的應(yīng)用 。由于rHSA在臨床上有廣泛的用途，所以其在國內(nèi)外有很大的市場需要，現(xiàn)階段盡管rHSA的純化技術(shù)已有一定的發(fā)展，但純化過程仍需優(yōu)化以提高產(chǎn)品純度及收率。

重組人血清白蛋白；人血白蛋白；分離純化；研究人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是由585個氨基酸

組成分子量為68KDa的蛋白組成，約占血漿總蛋白的60%，含17對二硫鍵。在人體內(nèi)起著相當(dāng)大的作用，如具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基(包括氨基酸，脂肪酸，金屬離子，類固醇及藥物)；組織進行交換等生理功能[1]。另外，人血清白蛋白在臨床上廣泛應(yīng)用于休克、大出血、燒傷、白蛋白過少癥等[2]。目前市場上銷售的 HSA商品都是提取純化人源血漿得到。然而人血來源有限，外加污染較為嚴(yán)重，如艾滋病及肝炎的蔓延，威脅人血制品的安全性，由此得出通過遺傳工程開發(fā)HAS勢在必行[3]。

1 rHSA與pdHSA的比較

1.1 結(jié)構(gòu)方面比較

經(jīng)高度純化后，rHSA與pdHSA在分子結(jié)構(gòu)上是一致的，是一條66.5-kDa單鏈、非糖基化多肽鏈，含17對二硫鍵和一個半胱氨酸位點，由585個氨基酸殘基組成。rHSA的三級結(jié)構(gòu)呈心形，67%為α-螺旋，不含β-折疊，由三個結(jié)構(gòu)域（I、Ⅱ和Ⅲ）組成，每個結(jié)構(gòu)域又各包含兩個亞結(jié)構(gòu)域[4]。Sadaharu等[5]分析了rHSA的三個結(jié)構(gòu)域與藥物的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)I型區(qū)域與藥物結(jié)合的能力最強，這是由其34位上游離的半胱氨酸殘基所決定的。

1.2 功能方面比較

作為pdHSA最可能的臨床替代品rHSA，在生理功能上具有與pdHSA十分相似性。用同位素125I標(biāo)記rHSA與pdHSA注射大鼠體內(nèi)靜脈，發(fā)現(xiàn)二者在組織分布、尿液和糞便代謝、血液半衰期等方面都無顯著差異[6]。在用于治療燒傷、白蛋白過少、出血性休克等病癥時，由于病理條件下，毛細血管對HSA的通透性會大大增加，如果過量輸入HAS，可能會透過毛細血管壁而導(dǎo)致器官水腫，從而使病情加重[7]。通過基因工程手段獲得的rHSA二聚體，在保留相應(yīng)的生理功能不變的情況下，既延長了其血漿半衰期，又降低了其毛細血管通過率，將很有可能解決這一問題[8]。

1.3 安全可靠性方面比較

近些年來pdHSA存在很多缺點，例如含有血源捐贈者自身所攜帶的病毒（如艾滋病病毒、肝炎病毒等）和其他潛在的致病因子，從而使患者在使用pdHSA制品時面臨很大風(fēng)險[9]。而影響rHSA安全應(yīng)用于臨床的主要潛在危險因素是其所含有的極少量酵母成分，包括蛋白質(zhì)和甘露聚糖等多糖成分，這些成分可能會在重復(fù)注輸時導(dǎo)致急性免疫反應(yīng)，從而危害患者健康[10]。因此，提高rHSA的分離純化技術(shù)，減少雜質(zhì)含量，會大大提高rHSA的安全性。

2 重組人血清白蛋白(Recombinant HSA，rHSA)的純化技術(shù)

近20年以來，國內(nèi)外很多實驗室和公司已經(jīng)開始嘗試通過遺傳工程方法來制備HSA。微生物產(chǎn)重組人血清白蛋白的專利在1989年已有發(fā)表[11]，至今 HSA基因已被引入真菌、細菌、動物以及植物中進行表達[12]。目前的研究集中于用細胞外分泌型的畢氏酵母發(fā)酵法制備HSA，由于其有表達量高，分泌的雜蛋白較少，易于純化等優(yōu)勢存在，是目前比較好的HSA生產(chǎn)方式，并且有進行大規(guī)模生產(chǎn)的潛力[13]。

采用畢氏酵母為宿主細胞，表達量已經(jīng)達到每升發(fā)酵液克級水平，甚至有的單位稱已經(jīng)達到更高水平，但rHSA的純化方面我國的研究仍遠不及日本等國家。

rHSA的純化不同于pHSA等血漿蛋白及其它的重組蛋白，主要在于：

（1）純化體系復(fù)雜。rHSA是通過酵母發(fā)酵生產(chǎn)的，由于發(fā)酵液中含有大量的酵母細胞組分和分泌物，如蛋白酶、雜蛋白、脂肪酸、核酸、多糖、色素、熱原物質(zhì)等[14]。另外如果不及時去除發(fā)酵液中的蛋白酶，rHSA就會被降解；終產(chǎn)物中如果含有酵母細胞組分，哪怕只有很少很少的含量，輸入人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為抗原，對于這種不同物種之間的相互作用，會對人體產(chǎn)生很大的危害。

（2）常用劑量大，純度要求非常之高。對于像疫苗這樣需要微量輸入的重組蛋白質(zhì)來說，99.999%的純度已經(jīng)足夠，但對于 rHSA達到這樣的純度程度還是不夠的。即使有很微量的有害雜質(zhì)，將可能產(chǎn)生致命的危險。

（3）HSA單位成本低，需求量大。

要想在市場上立足，rHSA的成本必須低于 pHSA才行。其中rHSA的純化成本占生產(chǎn)總成本的大部分，所以要實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，降低純化成本是根本。由此可見，rHSA走向工業(yè)化并商業(yè)化的兩大難點——成本和質(zhì)量 (即純度)將是對rHSA純化技術(shù)需解決的問題。

日本的 Green Cross公司對 rHSA的研究雖然不是起步最早，但發(fā)展很快，對高效表達、分泌rHSA的重組菌株構(gòu)建、發(fā)酵條件優(yōu)化、rHSA的分離純化、純品的鑒定、rHSA結(jié)構(gòu)分析以及 rHSA的工業(yè)化生產(chǎn)進行了大量系統(tǒng)性研究，野田宗宏等人在專利CN1127299A和CN11364643A中描述了酵母發(fā)酵后利用加熱發(fā)酵液、稀釋、調(diào)酸、擴張床陽離子層析、加熱、疏水層析、螯合吸附、陰離子交換、硼酸鈣沉淀等步驟得到高純度的rHSA[15]，其流程圖如圖1所示。目前我公司在此基礎(chǔ)上進行了改進工藝，提高了rHSA的純度，其流程圖如圖2所示。

圖1rHSA純化流程圖

圖2rHSA純化流程圖

3 展望

rHSA純化技術(shù)的研究已取得很大程度突破性進展，已經(jīng)有研究報道純度可高達99.999999%，接近與工業(yè)化。從分子結(jié)構(gòu)上來看，純化得到的高純度的rHSA與pHSA是完全相同，并且通過SDS-PAGE分析、HPLC分析、配基結(jié)合能力均相同[16]。rHSA的結(jié)構(gòu)不均一程度比pHSA要低[17]，含有的總脂肪酸量也略低。二者的免疫化學(xué)特性相同，理化功能相同[3]。但Wataru Ohtani等人對純化的rHSA進行免疫分析，結(jié)果得出，rHSA中仍殘存生產(chǎn)菌細胞蛋白及甘露聚糖等多糖成分。其中使人產(chǎn)生抗體的正是甘露聚糖，這樣一來就對輸注rHSA的安全性造成了很大的威脅[18]。并且在純化rHSA的研究中我們發(fā)現(xiàn)宿主細胞色素并沒有徹底去除。所以rHSA可否替代pHSA，或在何種前提條件下可以替代，仍然需要進一步的研究證實。因此，對如何解決產(chǎn)品純度問題包括去除色素、去除宿主蛋白質(zhì)及去除rHSA降解片段等仍需進行深入研究，尤其要加強純化過程集成，提高純化效率。由于高純度 rHSA的純化過程復(fù)雜，步驟繁多，成本高，收率低，實現(xiàn)全封閉式無污染自動化生產(chǎn)難度較大，因此為實現(xiàn)rHSA工業(yè)化產(chǎn)生了很大阻撓。雖然到目前為止，在世界范圍內(nèi)關(guān)于rHSA的生產(chǎn)仍未能實現(xiàn)工業(yè)化，但它代表了發(fā)展方向，是關(guān)于蛋白質(zhì)分離純化最富有挑戰(zhàn)性的研究。

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任華景(1985—)，女，助理工程師，研究方向為從事重組人血白蛋白純化研發(fā)工作。

曹明明］