張其安 申麗霞 盧德梅 楊少波

（1. 山東華康蜂業(yè)有限公司，日照 276500；2. 山東莒縣人民醫(yī)院，日照 276826）

1994年，Ash等（1994）在分子生物學(xué)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上將11個種從芽孢桿菌屬中分離出來另立類芽孢桿菌屬，并將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）立為類芽孢桿菌屬的模式菌種[1]。大量的研究表明，類芽孢桿菌屬的某些細(xì)菌具有顯著的生防潛力，同時類芽孢桿菌還具有生長快、營養(yǎng)簡單、可生成具抗逆能力的芽孢等特點[2]。近幾年來，國內(nèi)外有關(guān)類芽孢桿菌應(yīng)用與動植物疾病生物防治的報道日益增多。

歐洲幼蟲腐臭病簡稱歐幼病，是蜜蜂幼蟲的一種細(xì)菌性消化道傳染病，在世界各地均有發(fā)生，具有傳播迅速、發(fā)病快的特點，中蜂（Apis cerana Cerana Fabricius）比意蜂（Apis mellifera ligustica Spinola）更容易受感染[3]。歐洲幼蟲腐臭病是由多種致病菌共同作用而引起的，但其主要病原是蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）[4]。蜂房蜜蜂球菌是一種革蘭氏陽性菌，但有染色特性不穩(wěn)定，有時候可能為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧[5-6]。蜂房蜜蜂球菌抵御不良環(huán)境的能力極強(qiáng)，能在蜂尸上存活數(shù)年，在粉蜜里也能保持長久的毒性，所以歐洲幼蟲腐臭病是一種傳染性極強(qiáng)的蜜蜂傳染病。蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治方面的研究始于20世紀(jì)初，早期主要是以施用四環(huán)素、磺胺類抗生素為主[7]。隨著人們對無公害和綠色食品要求的與日俱增，蜂產(chǎn)品中多種抗生素殘留的檢測已經(jīng)成為許多國家蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢測的必檢項目，美國、歐盟、日本等國家已禁止含有多種抗生素殘留的蜂產(chǎn)品進(jìn)入本國，這對我國蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治工作又提出了新的要求[8]。Paenibacillus brasilensis HK-1由本實驗室從蜂場土壤中分離獲得，該菌株對蜂房蜜蜂球菌、蜂房哈夫尼菌、幼蟲芽孢桿菌、蜜蜂球囊菌等常見的蜜蜂細(xì)菌病病原物具有較強(qiáng)的拮抗作用，且發(fā)酵性狀優(yōu)良[9]。本試驗研究了大孔吸附樹脂對Paenibacillus brasilensis HK-1菌株抗菌物質(zhì)的提取，為該菌株及其抗菌物質(zhì)在蜜蜂細(xì)菌疾病防治方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌：Paenibacillus brasilensis HK-1由本實驗室分離鑒定

抗菌物質(zhì)效價指示菌：蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）由本實驗室保存。

1.1.2 大孔吸附樹脂

AB-8、X-5、D3520、D4020、H103、Nka-9由南開大學(xué)提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌株活化培養(yǎng)基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，瓊脂 15g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g， CaCO33.0g，蒸餾水1000mL。

菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g，CaCO33.0g，蒸餾水 1000mL。

發(fā)酵液效價生物測定培養(yǎng)基：底層培養(yǎng)基：瓊脂 18 g，蒸餾水1000mL；上層培養(yǎng)基：NaCl 10g，蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g，瓊脂 15g，蒸餾水1000mL，pH 6.8。

1.2 方法

1.2.1 抗菌物質(zhì)效價的測定

生物檢測平板的制備：采用雙層平板法。底層：在直徑為90mm的無菌平皿中加入15mL融化的發(fā)酵液效價生物測定培養(yǎng)基。上層：取滅菌冷卻到50℃~55℃的上層培養(yǎng)基，加入3%的蜂房蜜蜂球菌菌懸液，按照10mL/皿加入培養(yǎng)皿中；冷凝后備用。

效價測定：采用牛津杯法[10]。在每個平板上以等距離均勻放置牛津杯（內(nèi)徑6mm±0.1mm，高10mm±0.1mm，外徑8mm±0.1mm）4個。向每個杯中準(zhǔn)確加入250μL不同濃度的抗菌物質(zhì)溶液，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。37℃培養(yǎng)18 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌物質(zhì)的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌20min，以2%的接種量將種子液接種到250mL三角瓶中。200r/min，28℃震蕩培養(yǎng)48h。發(fā)酵液100℃滅菌10min，4200r/min離心30min，取上清液備用。

1.3 大孔吸附樹脂提取HK-1菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)

1.3.1 大孔吸附樹脂吸附性能比較

取1.1.2節(jié)中處理好的大孔吸附樹脂1g/份，分別加入1.2.2節(jié)中HK-1菌株發(fā)酵液上清液10mL，150r/min震蕩吸附4h，測定發(fā)酵液原液、吸附殘液效價，計算大孔吸附樹脂對HK-1菌株抗細(xì)菌物質(zhì)的吸附率。每個處理2個重復(fù)。

1.3.2 大孔吸附樹脂解吸性能比較

取1.3.1節(jié)中篩選出的吸附性能優(yōu)良的大孔吸附樹脂1g/份，分別加入1.2.2節(jié)中HK-1菌株發(fā)酵液上清液10mL，150r/min振蕩吸附4h。然后分別用50%、75%的乙醇、甲醇和丙酮解吸劑，150r/min振蕩靜態(tài)解吸4h。測定發(fā)酵原液、解吸液、吸附殘液的效價，計算解吸率，比較各種大孔吸附樹脂的解吸性能。每個處理設(shè)置2個重復(fù)。

1.3.3 丙酮濃度對解吸效果的影響

以體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%、90%的丙酮溶液為解吸劑，分別對吸附后的樹脂靜態(tài)解吸。測定發(fā)酵原液、解吸液、吸附殘液的效價，計算解吸率，比較不同濃度丙酮溶液的解吸效果。每個處理設(shè)置2個重復(fù)。

1.3.4 X-5樹脂飽和吸附量的測定

取篩選到的X-5樹脂1g/份，分別加入HK-1抗菌物質(zhì)粗物（發(fā)酵液上清經(jīng)以上篩選到的最佳吸附樹脂、解吸液吸附、解吸后，解吸液經(jīng)濃縮、冷凍干燥所得固體粉末為抗菌物質(zhì)粗物）5g/L的溶液5mL、10mL、20mL、30mL、40mL，150r/min振蕩吸附4h。測定抗菌物質(zhì)粗物溶液、吸附殘液的效價，計算樹脂的吸附量。每個處理設(shè)置2個重復(fù)。

1.3.7 90%丙酮溶液動態(tài)解吸曲線及動態(tài)解吸率的測定

X-5樹脂：提取液1：10（m/V），150r/min振蕩吸附4h。棄去上清液，樹脂用去離子水沖洗3次后裝入直徑16mm，柱長400mm的層析柱，先用3倍柱體積的30%丙酮溶液洗脫。然后用90%的丙酮溶液對進(jìn)行動態(tài)解吸。流速為1mL/min，用自動部分收集器分管收集解吸液，每10min收集一管，每管10mL，測定發(fā)酵原液、吸附殘液以及每管解吸液的效價，繪制解吸曲線并計算動態(tài)解吸率。

1.4 HK-2菌株抗菌物質(zhì)的部分理化性質(zhì)

1.4.1 對熱的穩(wěn)定性

配制抗菌物質(zhì)粗物溶液（5g/L），分別于50℃、70℃、100℃水浴中處理10min、20min、40min、60min、80min、100min，牛津杯法測定其效價，比較抗菌物質(zhì)的效價變化。

1.4.2 抗菌物質(zhì)對酸堿的穩(wěn)定性

抗菌物質(zhì)粗物分別溶于pH為1.2、2.4、3.1、4.9、6.8、10.3和12.4的緩沖液溶液，室溫靜置12h，比較抗菌物質(zhì)效價變化。

1.4.3 對紫外線的穩(wěn)定性

抗菌物質(zhì)粗物水溶液置于紫外燈下40cm，分別輻照2h、4h、6h和8h，比較抗菌物質(zhì)效價變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯法測定效價工作曲線的建立

以抗細(xì)菌活性物質(zhì)濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。可見，濃度的對數(shù)值與抑菌圈直徑呈線性關(guān)系，其決定系數(shù)R2＝0.9935，可以滿足效價測定的要求。由此，可得到發(fā)酵液效價計算方程：Y=10（x+4.0913）/6.0594×n〔Y：發(fā)酵液效價（μg/mL）；x：抑菌圈直徑（12.3mm

圖1 牛津杯法測定效價工作曲線

2.2 大孔吸附樹脂吸附性能的比較

各種大孔吸附樹脂對HK-1抗菌物質(zhì)的吸附效果如圖2所示?？梢钥闯?，大孔吸附樹脂X-5、AB-8、Nka-9對抗菌物質(zhì)吸附率達(dá)90%以上，其它幾種樹脂吸附性能較差。選擇X-5、AB-8、Nka-9樹脂繼續(xù)考察其解吸性能。

圖2 大孔吸附樹脂吸附性能比較

2.3 大孔吸附樹脂解吸性能比較

分別采用不同有機(jī)溶劑作為解吸劑對抗菌物質(zhì)進(jìn)行解吸。由圖3可以看出，同一種有機(jī)溶劑，濃度高的有機(jī)溶劑解吸效果優(yōu)于濃度低的有機(jī)溶劑；不同有機(jī)溶劑以75%的丙酮解吸效果最好。4種樹脂以X-5解吸效果最好，其靜態(tài)解吸率達(dá)68%。因此，選擇X-5為HK-1抗菌物質(zhì)的最佳吸附樹脂，進(jìn)一步篩選最佳解吸劑的濃度。

圖3 大孔吸附樹脂解吸性能比較

2.4 丙酮濃度對解吸效果的影響

已篩選到的X-5樹脂為抗菌物質(zhì)的吸附樹脂，考察不同濃度丙酮對抗菌物質(zhì)的解吸效果。結(jié)果如圖4所示，丙酮濃度在40%～80%范圍內(nèi)解吸率逐漸升高，80%的丙酮解吸率最高，解吸率為73%。

圖4 丙酮濃度對解吸率的影響

2.5 X-5樹脂飽和吸附量的測定

以抗菌物質(zhì)粗物的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，繪制X-5樹脂的吸附曲線，結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，隨著抗菌物質(zhì)粗物質(zhì)量的增加，吸附率逐漸降低，1g樹脂加入6mg抗菌物質(zhì)粗物時吸附率可達(dá)97.5%。試驗選取吸附率為97.5%時樹脂吸附的抗菌物質(zhì)的質(zhì)量為吸附量。經(jīng)測定X-5樹脂的飽和吸附量為5.85mg/g。

圖5 X-5樹脂對抗菌物質(zhì)的吸附量

2.6 80%丙酮動態(tài)解吸曲線

以80%丙酮HK-1抗菌物質(zhì)進(jìn)行動態(tài)解吸。解吸曲線如圖6所示，解吸液中抗菌物質(zhì)濃度較為集中，解吸效果較好，經(jīng)計算各管的解吸率，結(jié)果總解析率為95.3%。這一結(jié)果說明，試驗篩選的樹脂和解吸劑均比較理想。

3 討論

圖6 X-5樹脂的動態(tài)解吸曲線

利用微生物活體防治蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病不僅有對其釋放風(fēng)險的擔(dān)憂，也受釋放技術(shù)及環(huán)境溫度、濕度等諸多因素的限制，所以研究者更期望從拮抗菌種提取活性物質(zhì)用于生物防治[11]。樹脂法提取活性物質(zhì)具有設(shè)備簡單、操作方便、生產(chǎn)周期短、能耗和成本低、無需添加輔料等優(yōu)點，利于工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)[12]。本研究采用大孔吸附樹脂X-5提取Paenibacillus brasilensis HK-1菌株發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，為該抗菌物質(zhì)的純化及其在蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病防治方面的應(yīng)用提供了理論參考。

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