梅竹 楊予濤 徐志卿

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069）

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），是一種具有多種生物學(xué)活性的多肽類細胞因子，由多種組織細胞合成，調(diào)控細胞周期，影響細胞的增殖、分化、黏附、轉(zhuǎn)移和凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［13］。TGF-β信號通路主要由TGF-β與其相應(yīng)的受體和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子組成。TGF-β信號通路的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子主要由Smads蛋白構(gòu)成。Smads蛋白主要由受體激活的Smads（R-Smad）、通用型Smads（Co-Smad）和抑制型Smads（I-Smad）構(gòu)成。受體激活的Smads主要包括Smad2和Smad3，通用型Smads只包括Smad4，抑制型Smads包括Smad6和Smad7。

Smad4基因共有11個外顯子，10個內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄子長2 680 bp，編碼由552個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，主要由MH1結(jié)構(gòu)域、MH2結(jié)構(gòu)域和連接區(qū)所組成。MH1結(jié)構(gòu)域具有序列特異的DNA結(jié)合能力，MH2結(jié)構(gòu)域是形成同/異源聚合物的結(jié)合位，同時還具有轉(zhuǎn)錄激活和核定位功能［3］。Smad4作為一種抑癌基因，是TGF-β信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細胞分化、增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程［4］。

當細胞被TGF-β激活后，引起R-Smads（Smad2和Smad3）的磷酸化，而磷酸化的R-Smads從受體復(fù)合物上解離，迅速與Smad4形成異源復(fù)合物，然后被轉(zhuǎn)運進細胞后，與Smad結(jié)合元件（SBE）結(jié)合，并在其它輔助因子的協(xié)同下，調(diào)節(jié)靶基因的表達［5］。因此，在TGF-β信號通路中，Smad4處于中樞地位。鑒于Smad4在TGF-β信號通路中處于的關(guān)鍵地位，本研究擬在體外表達并純化Smad4蛋白，旨在分離和鑒定與Smad4相互作用的蛋白，從而進一步豐富TGF-β信號通路的組成。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）均為本實驗室保存；高保真Taq聚合酶購于Roche公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒購于MN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen 公司；各種限制性內(nèi)切酶購于NEB公司；Smad4抗體購于Milipore公司；MagneGST particles購于Promega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）、考馬斯亮藍R-250購于北京普利萊公司；預(yù)染分子量標準蛋白marker購于Fermentas公司；引物合成與DNA測序由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞總RNA的提取 將長滿培養(yǎng)瓶的HaCaT細胞用PBS洗兩遍，加入1 mL的Trizol（Invitrogen），等細胞充分裂解后，將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中。加入0.2 mL的氯仿，震蕩混勻，室溫放置3 min。4℃，12 000×g離心10 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中。加入0.5 mL的異丙醇，室溫靜置20 min。4℃，12 000×g離心10 min，并用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，等沉淀干燥后，加入50 μL無RNase的水，用槍頭洗打，使沉淀充分溶解。利用紫外分光光度計測定總RNA的濃度，用甲醛變性膠檢測總RNA的質(zhì)量。

1.2.2 HaCaT細胞總RNA的反轉(zhuǎn)錄 在一個無RN-ase的離心管中加入5 μg的總RNA，1 μL的OligodT，并用無RNase的水調(diào)節(jié)體積到12 μL。70℃水浴變性5 min后，將離心管迅速放置在冰上。加入4 μL的 5×reaction buffer，1 μL 的 RNase inhibitor，2 μL 10 mmol/L dNTP 和 1 μL 的 SuperScript?III Reverse Transcriptase，42℃水浴 60 min。加入 1 μL RNase H，37℃溫浴10 min。將RT產(chǎn)物稀釋到200 μL，-20℃保存。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建pGEX-4T-1-Smad4載體的上游引物5'-TACTCGGATCCATGGACAATATGTCTA TTACG-3'（下劃線處為BamH I酶切位點），下游引物5'-ATCACGTCGACCAGTCTAAAGGTTGTGGGTCT-3'（下劃線處為SalI酶切位點）。以HaCaT細胞的cDNA為模板，利用上述引物，進行PCR擴增。擴增條件為：94℃預(yù)變性2 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s；30個循環(huán)。將擴增到的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體分別用SalI內(nèi)切酶和BamH I內(nèi)切酶進行雙酶切，并將酶切后的PCR片段與剩余載體片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證陽性克隆，并將陽性克隆送往北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.4 GST-Smad4融合蛋白的誘導(dǎo)表達 將構(gòu)建成功的pGEX-4T-1-Smad4載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達菌中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6時，分別加入 1 mol/L的IPTG，至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。30℃誘導(dǎo)4-5 h，同時設(shè)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液做對照。取1 mL誘導(dǎo)后的菌液，10 000 r/min 離心2 min，收集菌體，然后加入40 μL的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，然后10 000 r/min離心2 min，取上清用于SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色，檢測GST-Smad4融合蛋白的表達情況。

1.2.5 GST-Smad4融合蛋白的純化 收集1 mL誘導(dǎo)后的細菌，加入200 μL的裂解液，槍頭混勻，室溫搖動30 min。同時，在另一個離心管中加入20 μL的MagneGST particles，利用磁架，將上清吸去，再加入250 μL Binding/Washing buffer，懸浮磁粉，利用磁架，吸去上清，平衡磁粉。將平衡好的MagneGST particles加 入 100 μL 的 Binding/Washing buffer， 再加入100 μL的細菌裂解液，室溫搖動30 min。利用磁架，吸去上清，加入250 μL的Binding/Washing buffer洗滌3次，吸取上清。用30 μL的0.1 mol/L谷胱甘肽洗脫融合蛋白，并在洗脫液中加入8 μL 的5×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，10 000 r/min 離心2 min，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測融合蛋白的純化效果。

1.2.6 GST-Smad4融合蛋白的鑒定 將純化后GSTSmad4融合蛋白和HaCaT細胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2 h，按1∶1 000的比例加入Smad4單克隆抗體，孵育3 h后，洗去一抗，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，孵育40 min后，洗去二抗，再利用ECL顯色發(fā)光試劑盒并結(jié)合膠片顯影觀察試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Smad4基因的PCR擴增

提取HaCaT細胞總RNA，電泳檢測RNA完整性良好，可用于反轉(zhuǎn)錄試驗。以HaCaT細胞的cDNA為模板進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到1 700 bp左右的擴增產(chǎn)物，與Smad4基因的預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1 Smad4基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 pGEX-4T-1-Smad4原核表達載體的構(gòu)建

將擴增的Smad4基因片段和pGEX-4T-1載體分別用SalI內(nèi)切酶和BamH I內(nèi)切酶進行雙酶切，電泳并回收酶切后的Smad4基因片段和pGEX-4T-1載體的大片段，通過T4 DNA連接酶將Smad4基因定向插入到pGEX-4T-1載體的多克隆位點中。將菌落PCR鑒定為陽性的2個重組子再進行酶切鑒定，2個重組子經(jīng)酶切鑒定后均得到兩條目的帶，大約為1 700 bp和4 900 bp（圖2），初步證明重組載體構(gòu)建正確。將2個重組子進行測序。經(jīng)過與GenBank的序列對比后，證明Smad4基因已經(jīng)成功插入pGEX-4T-1載體，pGEX-4T-1-Smad4構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Smad4的鑒定

2.3 GST-Smad4融合蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

將重組載體pGEX-4T-1-Smad4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），收集細菌進行SDS-PAGE凝膠電泳，并用考馬斯亮藍染色。試驗結(jié)果（圖3）顯示，5個GST-Smad4誘導(dǎo)組在80 kD處均出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而未誘導(dǎo)的GST-Smad4表達菌在相應(yīng)位置無蛋白條帶出現(xiàn)，說明融合基因在大腸桿菌中得到有效的表達。但是，隨著IPTG濃度的增高，融合蛋白的表達量并未增強。同時，將0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下的GST-Smad4表達菌裂解，收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測其可溶性。從圖4中可以看出，GST-Smad4的融合蛋白主要在上清中表達，說明在30℃培養(yǎng)下，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的GST-Smad4融合蛋白主要以可溶性的形式存在。

2.4 GST-Smad4融合蛋白的純化

圖3 不同濃度IPTG誘導(dǎo)下GST-Smad4 融合蛋白的表達分析

圖4 0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下GST-Smad4 融合蛋白在上清和沉淀中的對比

將0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的GST-Smad4表達菌在-80℃放置1 h，將其融化，加入裂解液，超聲破碎后，收集上清，加入MagneGST particles，通過結(jié)合、洗滌等步驟后，用0.1 mmol/L的谷胱甘肽洗脫GSTSmad4融合蛋白，并將純化的GST-Smad4融合蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后考馬斯亮藍染色。如圖5所示，GST-Smad4融合蛋白得到較好的純化，純度較高。

圖5 GST-Smad4 融合蛋白的純化

2.5 GST-Smad4融合蛋白的鑒定

分別將HaCaT細胞總蛋白和純化的GST-Smad4融合蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，再將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，通過Western blot，檢測融合蛋白能否被Smad4抗體特異識別。由于GST-Smad4蛋白比Smad4蛋白多了一個GST標簽（約20 kD），其分子量預(yù)計在80 kd左右。如圖6所示，GST-Smad4融合蛋白的條帶出現(xiàn)在預(yù)期位置，說明Smad4的特異性抗體可以識別GST-Smad4融合蛋白，暗示GSTSmad4融合蛋白可用于后續(xù)的研究。

圖6 GST-Smad4 融合蛋白的鑒定

3 討論

Smad4是Smads基因家族的成員，最早被稱為DCP4，位于人類染色體18q21.1上［6］。Smad4作為一種抑癌基因，主要通過與其它Smads蛋白的相互作用而參與TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如果Smad4發(fā)生缺失或突變，則TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)就會被破壞，TGF-β信號途徑在腫瘤發(fā)展中的抑制效應(yīng)就會失［7］。

Smad4除了參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展外，還具有其它的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒編碼的癌蛋白pX通過促進Smads蛋白的核轉(zhuǎn)運和穩(wěn)定Smad4蛋白的復(fù)合體而增強TGF-β信號通路，從而參與肝臟的纖維化［8］。同時，Smad4還參與睪丸、小腦、心瓣膜和早期胚胎的發(fā)育過程［9-12］。 因此，Smad4在生命過程中起到十分重要的調(diào)節(jié)作用。

鑒于Smad4在TGF-β信號途徑中的中樞地位，發(fā)現(xiàn)和鑒定Smad4的共調(diào)節(jié)因子具有重要的意義。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個Smad4的共調(diào)節(jié)因子，如Bcl6，v-ErbA。Bcl6主要通過直接與Smad4的相互作用來抑制Smad4的轉(zhuǎn)錄活性，從而使B淋巴瘤細胞產(chǎn)生 TGF-β抗性［13］。v-ErbA通過與Smad4相互作用而干擾Smad4復(fù)合體向細胞核的轉(zhuǎn)移，從而抑制了TGF-β信號通路的正常功能，進而使HD3B紅白血病細胞產(chǎn)生TGF-β抗性［14］。因此，進一步的鑒定和發(fā)現(xiàn)Smad4的共調(diào)節(jié)因子對完善復(fù)雜的TGF-β信號網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義。

Biacore是一種基于表面等離子共振（SPR）的新型技術(shù)，利用該技術(shù)可以實時跟蹤生物分子間的相互作用，分離與目的蛋白相互作用的蛋白，我們實驗室擬利用這種技術(shù)分離與Smad4相互作用的蛋白。在Biacore試驗中，獲得Smad4蛋白是試驗順利進行的關(guān)鍵。為此，將Smad4基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-1載體，通過IPTG誘導(dǎo)，得到帶有GST標簽的Smad4融合蛋白，再通過親和層析純化，得到了GST-Smad4融合蛋白，本研究為Biacore試驗奠定了基礎(chǔ)。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，IPTG的濃度對外源蛋白的表達有著重要的影響，但是過高濃度的IPTG往往對細胞產(chǎn)生毒性，同時也影響蛋白的表達量和蛋白表達的形式。本試驗探索了不同濃度的IPTG對GSTSmad4融合蛋白表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著IPTG濃度的增加，GST-Smad4融合蛋白表達幾乎沒有變化。因此，選擇0.2 mmol/L為IPTG誘導(dǎo)的濃度。同時，分別檢測了在0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下，GSTSmad4融合蛋白在BL2（DE3）表達菌裂解液的上清和沉淀的分布發(fā)現(xiàn)，低濃度的IPTG誘導(dǎo)下，GSTSmad4融合蛋白主要以可溶性的形式存在，主要分布在上清，而在沉淀中的分布很低。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-Smad4原核表達載體，摸索了GST-Smad4融合蛋白誘導(dǎo)表達的適宜條件，并獲得了具有Smad4免疫活性的GST-Smad4融合蛋白。

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