王亞東 楊留才 徐紅濤 李仕紅

(1.阜寧縣人民醫(yī)院， 江蘇 阜寧 224400；2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 鹽城 224005)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的發(fā)病率的第二位，死亡率占惡性腫瘤的第三位[1]。目前的研究認(rèn)為我國(guó)胃癌的發(fā)生可能和癌前病變、飲食習(xí)慣、吸煙、酗酒、幽門螺桿菌感染和家族史有關(guān)[2]。早期胃癌癥狀隱匿，患者出現(xiàn)自覺癥狀時(shí)往往已是中晚期，喪失了早期治療、提高生存率的機(jī)會(huì)。研究表明，P21 和Cyclin E在多種惡性腫瘤中的表達(dá)均較正常組織發(fā)生了明顯的改變，而上述兩種細(xì)胞因子均和細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)[3，4]。本次研究通過檢測(cè)P21和Cyclin E在胃癌組織中陽性表達(dá)率，并且研究?jī)烧叩年栃员磉_(dá)之間是否存在相關(guān)性，從而試圖為胃癌的診斷和治療提供一種新的思路。

1 資料和方法

1.1病例資料收集自2009年1月至2011年12月3年間在我院普外科就診并且手術(shù)治療，并且經(jīng)過病理診斷確診為胃腺癌的蠟塊標(biāo)本98例作為試驗(yàn)組，其中男性患者63例，女性患者35例，平均年齡(46.57±17.68)歲；按照年齡進(jìn)行分類，按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control, UICC)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胃腺癌患者進(jìn)行分期，Ⅰ期17例，Ⅱ期23例，III期36例，IV期22例；病理診斷為高分化31例，中分化42例，低分化癌25例；術(shù)后病理診斷確認(rèn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，胃腺癌患者在進(jìn)行手術(shù)之前均沒有經(jīng)過化療等治療措施。采集病理標(biāo)本均采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。另外取病理診斷為正常胃黏膜的蠟塊標(biāo)本34例作為對(duì)照組，標(biāo)本來自于胃潰瘍切除術(shù)或者十二指腸切除術(shù)的患者，均通過病理診斷排除了高度不典型增生，其中男性患者20例，女性患者14例，平均年齡(47.23±18.49)歲。胃癌組和對(duì)照組的年齡、性別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 切片厚度為5μm，脫蠟水化后微波修復(fù)5min，3%過氧化氫孵育10min去除內(nèi)源性過氧化物酶， 加兔抗人Cyclin E一抗( 1∶200, 德國(guó)Merck公司) ，兔抗人P21一抗(1∶400, 德國(guó)Merck公司)，室溫過夜，PBS清洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗( 1：100，美國(guó)Santa Cruz公司)室溫孵育40 min；PBS清洗，加Elite-AP(英國(guó)Vector公司)孵育15min，PBS清洗，DAB底物液(中國(guó)邁新公司)顯色3min，蘇木素復(fù)染30sec，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3染色結(jié)果判斷 染色結(jié)果顯示Cyclin E和P21均定位于胞核中，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色染色作為陽性。在高倍鏡(×400)下選取陽性細(xì)胞最多的5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞在全部組織細(xì)胞中所占比例判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽性細(xì)胞數(shù)占全部組織細(xì)胞數(shù)比例<5%判斷為(-)，陽性細(xì)胞數(shù)占全部組織細(xì)胞數(shù)比例為5%～49%之間判斷為(+)，陽性細(xì)胞數(shù)占全部組織細(xì)胞比例陽性細(xì)胞數(shù)≥50%判斷為(++)，以(+)及(++)以上判斷為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，各組樣本之間的比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Cyclin E和P21之間的相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P≤0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Cyclin E和P21在不同組織中的陽性表達(dá)情況 Cyclin E和P21在對(duì)照組和胃腺癌組中的表達(dá)情況見表1。Cyclin E在胃腺癌組中的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.80，P<0.05)P21在對(duì)照組中陽性表達(dá)率高于胃腺癌組，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.03，P<0.05)。

表1 Cyclin E和P21在不同胃組織中陽性表達(dá)率

2.2Cyclin E和P21在胃癌組織中表達(dá)以及與臨床、病理指標(biāo)關(guān)系 Cyclin E和P21在胃癌組織陽性表達(dá)情況與性別、臨床分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床、病例指標(biāo)的關(guān)系見表2。

表2 Cyclin E和P21在胃癌組織中表達(dá)以及與臨床病理指標(biāo)關(guān)系

2.3Cyclin E和P21在胃癌組織表達(dá)的相關(guān)性 使用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析二者之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果為r=-0.51，P<0.05，提示Cyclin E和P21在胃癌組織組織表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。

表3 Cyclin E和P21在胃癌組織表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

本次研究通過免疫組化的方法來研究Cyclin E和P21在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Cyclin E在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率明顯的低于胃癌組織，而P21在上述兩種組織中的陽性表達(dá)率正好相反，并且兩者之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；通過進(jìn)一步分析Cyclin E和P21在胃癌陽性表達(dá)情況與性別、臨床分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cyclin E在胃癌中陽性表達(dá)率和性別無關(guān)，但是上述兩種細(xì)胞因子和臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cyclin E 是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，能夠有效的促進(jìn)細(xì)胞周期，是一種正性的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子[5]。目前的研究表明Cyclin E在G1 期能夠和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)素依賴性激酶2(Cyclin dependence kinase 2; CDK2)結(jié)合，并且使CDK2活化，活化的CDK2能夠使得視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma; Rb)磷酸化，磷酸化的Rb蛋白能夠活化轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)DNA合成，促使細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期，從而加速細(xì)胞增殖[6，7]。而P21 是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，也是一種抑癌基因，在正常細(xì)胞周期中， P21 的功能是抑制CDK2、CDK4和CDK6等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)素依賴性激酶被磷酸化，從而抑制Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等復(fù)合物的活性，從而使得Rb不能磷酸化，進(jìn)而使得E2F不能被活化，阻止細(xì)胞進(jìn)入S 期，從而阻斷細(xì)胞周期[8，9]。我們的研究表明，P21在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率明顯的高于胃癌組織，并且在臨床分期晚、低分化和有淋巴轉(zhuǎn)移的組織中的陽性表達(dá)率明顯的低于臨床分期早、高分化沒有淋巴轉(zhuǎn)移的組織，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。現(xiàn)有的研究表明，P21表達(dá)水平下降或者P21基因發(fā)生突變，即由野生型P21變?yōu)橥蛔冃蚉21，都能夠?qū)е聦?duì)Cyclin E/CDK2、Cyclin E/CDK4等復(fù)合物抑制減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期過快運(yùn)行，細(xì)胞增殖明顯增加，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[10]。

本研究還顯示Cyclin E與P21在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示P21可能通過影響Cyclin E的表達(dá)水平來調(diào)控細(xì)胞的凋亡，其主要的作用機(jī)制在于P21能夠通過直接抑制Cyclin E/CDK2復(fù)合物的活性，推遲細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。而P21表達(dá)水平下調(diào)則會(huì)減少Cyclin E/CDK2復(fù)合物的抑制作用，從而刺激細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]。

我們的研究結(jié)果表明，Cyclin E在胃癌的組織中陽性表達(dá)率高，并且其表達(dá)水平和臨床分期、病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；P21在胃癌的組織中陽性表達(dá)低，并且其表達(dá)水平和臨床分期、病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；Cyclin E和P21在胃癌的組織負(fù)相關(guān)，提示Cyclin E和P21胃癌的發(fā)生起到了協(xié)同作用。

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