高 豐 劉思思 韓佩妍 王武龍，2鄒 瑞 王 剛 曹 陽(yáng) 吳海歌王若雨 高文斌

2116622 遼寧大連，包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放療科

3116622 遼寧大連，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科4116622 遼寧大連，大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

高 豐，劉思思，韓佩妍，等.拓?fù)涮婵嫡T導(dǎo)肺癌細(xì)胞HTB-56凋亡早期線粒體膜電位的變化［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):51-53.

目前肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤之一，近幾十年肺癌的治療尚未能獲得較大的進(jìn)展，非小細(xì)胞肺癌的5年生存率仍然低于15%，大部分患者多在確診后1年內(nèi)死亡［1-3］。拓?fù)涮婵?topotecan，TPT)是半合成喜樹(shù)堿合成物，主要作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，Topo-Ⅰ)，并與Topo-Ⅰ相結(jié)合，形成酶-DNA-TPT結(jié)合物，阻止腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞雙鏈斷裂。TPT抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡可能涉及caspase-3、8、9及Fas-FasL系統(tǒng)的激活，但誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。我們?cè)谇捌诨A(chǔ)研究上，初步明確了TPT對(duì)肺癌HTB-56細(xì)胞凋亡的影響［4-5］，本研究擬進(jìn)一步觀察TPT對(duì)肺癌HTB-56細(xì)胞線粒體的影響，并探討TPT對(duì)線粒體早期功能的影響及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人肺癌細(xì)胞HTB-56細(xì)胞由本教研室保存，TPT是貴州漢方制藥有限公司產(chǎn)品，JC-1為BioVision公司的產(chǎn)品，二甲基亞砜購(gòu)于sigma公司DMEM購(gòu)于Gibco公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):人肺癌細(xì)胞HTB-56培養(yǎng)于青霉素105IU/L、鏈霉素 100 mg/L，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下，含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)分裂期。

2.確定實(shí)驗(yàn)用的TPT的濃度:依照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定 TPT 實(shí)驗(yàn)用量為 6.4 μmol/L［4-5］。

3.細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)檢測(cè):在TPT給藥后分別于 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h 檢測(cè)細(xì)胞線粒體跨膜電位。參照J(rèn)C-1試劑盒步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀分析，通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變檢測(cè)線粒體膜電位的變化。檢測(cè)在流式細(xì)胞儀FACSCALIBUR上進(jìn)行。JC-1的單體和聚合物熒光信號(hào)分別在FL-1和FL-2探測(cè)器上獲得。由于JC-1發(fā)射的雙波長(zhǎng)，使用電子補(bǔ)償?shù)募m正綠色熒光(單體)和紅色熒光(聚合物)的重疊部分。圖分析采用CELL QUEST軟件進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次，圖象顯示代表性的結(jié)果。

4.瓊脂糖凝膠電泳:細(xì)胞3×105接種，過(guò)夜貼壁，調(diào)節(jié)藥物濃度，分別TPT作用12 h、24 h、48 h和72 h，收集細(xì)胞，離心，PBS洗 2次，加入 600 μl含10 mmol·L的 Tris-HC1，加入 10 mmol/L的 EDTA和2 g/L的Triton X-100的裂解液于4℃裂解10～15 min;將裂解液收集于1.5 ml的EP管中，與等體積酚混勻，抽提1次，12 000 r/min，4℃離心10 min取550 μl上清于另一EP管中，加入等體積的1︰1酚、氯仿混合液抽提1次，再次離心。取500 μl上清，加入300 mmol/L的乙酸鈉和等體積的異丙醇，沉淀過(guò)夜。離心，70%乙醇洗滌2～3次;干燥后加入 TE(Tris10 mmol/L;EDTA 1.0 mmol/L 和0.6 g/L的Rnase A)37℃溫育30 min;樣品放在20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳1 h，溴乙啶染色后在紫外燈下觀察拍照。

結(jié) 果

一、線粒體膜電位變化

JC-1試劑盒測(cè)定結(jié)果表明，正常細(xì)胞的膜電位高，488 nm激發(fā)時(shí)發(fā)出很強(qiáng)的紅色熒光，而凋亡細(xì)胞線粒體的膜電位發(fā)生去極化，紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，綠/紅熒光的比值發(fā)生了變化。圖1顯示:加入TPT藥物作用4 h后可以引起細(xì)胞線粒體膜電位的下降，作用8 h后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降。且該兩藥物組的綠/紅熒光比值與對(duì)照組比較，均有顯著差異(P＜0.05)。8 h組的綠/紅熒光比值與其他各藥物配比組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 TPT作用于HTB-56細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞線粒體膜電位(綠光與紅光比值)的影響

二、瓊脂糖凝膠電泳

經(jīng)TPT處理48 h、72 h的HTB-56細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNA-Ladder，對(duì)照組及12 h、24 h組未見(jiàn)明顯的亮帶影，見(jiàn)圖2。

討 論

TPT是半合成喜樹(shù)堿合成物，其作用靶點(diǎn)主要在Topo-Ⅰ，通過(guò)與Topo-Ⅰ結(jié)合，形成酶-DNA-TPT穩(wěn)定結(jié)合物，阻止DNA雙鏈解螺旋的發(fā)生，抑制修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致雙鏈斷裂，產(chǎn)生抗腫瘤作用。TPT抗瘤譜廣，可用于結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、進(jìn)展期的宮頸癌［6-7］。

腫瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)方式與其異常增殖、分化有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)。細(xì)胞凋亡的途徑包括外部途徑，即通過(guò)細(xì)胞外死亡受體激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶半胱氨酸特異性蛋白酶(caspase-8)，和內(nèi)部途徑，即通過(guò)改變線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)使多種促細(xì)胞凋亡因子從線粒體內(nèi)外膜間隙(intermembrane space，IMS)釋放到胞質(zhì)，從而激活Caspase-9，最后激活Caspase-3。這些活化的Caspase降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白，引起細(xì)胞凋亡［8］。有研究認(rèn)為，即使Caspase-9受抑制，僅有MOMP改變也可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9］。

我們?cè)谇捌谠囼?yàn)中已證實(shí)了TPT對(duì)肺癌細(xì)胞HTB-56有抑制作用，其機(jī)制是誘導(dǎo)凋亡，且與caspase-3、8 有關(guān)［4-5］。線粒體與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，線粒體跨膜電位破壞是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件之一，其發(fā)生在染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂等細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前，線粒體跨膜電位崩潰，細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用JC-1檢測(cè)早期膜電位的變化，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。正常的細(xì)胞膜電位較高，而當(dāng)出現(xiàn)凋亡時(shí)，膜電位下降。本實(shí)驗(yàn)中證實(shí)在4 h時(shí)該實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)出線粒體膜電位的變化，經(jīng)過(guò)繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，72 h通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)明顯的凋亡。由此可見(jiàn)HTP-56細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，且該凋亡與線粒體有關(guān)。線粒體是細(xì)胞維持生命活動(dòng)的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞存活及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

凋亡是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，不同的誘因可通過(guò)相同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，并且不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑也不是孤立發(fā)揮作用，而是緊密聯(lián)系和相互作用的，整個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)控結(jié)構(gòu)。隨著越來(lái)越多的研究，可以使得我們可以找到更多、更有效的治療腫瘤的切入點(diǎn)，并且有效拮抗凋亡抑制因子的作用，最大限度地選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并有效地利用誘導(dǎo)凋亡來(lái)控制腫瘤。

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5 高文斌，馬建增，鄭真真，等.拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用的研究［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2011，38(12):54-55.

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