陳麗麗 張新日 李 陽

陳麗麗，張新日.卡托普利對大潮氣量機械通氣大鼠肺組織小窩蛋白-1表達的影響［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):46-50.

呼吸機所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機械通氣的嚴重并發(fā)癥，也是目前醫(yī)學界研究的熱點問題。據(jù)文獻報道，小窩蛋白-1(cavedin，Cav-1)在肺組織中的表達水平減低參與了VILI的發(fā)病過程，但其機制尚不明確［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞上Cav-1的表達水平受AngⅡ的調(diào)節(jié)［2］。但VILI時肺組織中Cav-1表達是否受AngⅡ的調(diào)節(jié)，應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑能否增加Cav-1的表達水平尚有待深入研究。本實驗通過觀察血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑—卡托普利干預后大鼠肺組織AngⅡ及Cav-1表達量的變化，旨在探討卡托普利對大潮氣量機械通氣致大鼠急性肺損傷的防治作用。

材料與方法

一、動物分組與處理

24只雄性健康 Sprague-Dawley大鼠(體質(zhì)量300～350 g，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，隨機分為3組，每組8只動物:①對照組:未行機械通氣;②大潮氣量組(H-VT組):VT:40 ml/kg;③卡托普利干預組(CAP組):通氣前30 min經(jīng)腹腔注射卡托普利(100 mg/kg)。

25%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開氣管插管術。除對照組外，余各組大鼠均與小動物呼吸機(DH-150型，浙江大學醫(yī)學儀器廠制造)相連行機械通氣。機械通氣參數(shù)統(tǒng)一設置為:VT:40 ml/kg，f:60 次/min，I/E:1/3，PEEP 為0，吸入氣體為室內(nèi)空氣，通氣時間為2 h。

二、標本收集與制備

通氣結(jié)束后，腹主動脈放血處死大鼠，完整切取肺臟。左肺行支氣管肺泡灌洗術(4℃生理鹽水灌注4 ml×4次，回收量大于80%)，支氣管肺泡灌洗液 (bronchialalveolarlavage fluid， BALF)經(jīng)3000 r/min離心10 min，取上清液－70℃凍存待測;取右肺上葉－70℃凍存，用于測定AngⅡ含量;取右肺中葉計算肺組織干/濕(W/D)比值;取右肺下葉用4%福爾馬林液固定，行石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理學改變，免疫組織化學法(SABC法)檢測肺組織Cav-1的表達水平。

三、檢測方法

1.肺組織W/D比值測定:取右肺中葉，用生理鹽水沖洗干凈表面血跡，無菌紗布吸干表面液體后稱重(即濕重)，后置于60℃烤箱中過夜，再稱重(即干重)，計算肺組織W/D比值。

2.BALF中總蛋白(TP)含量測定:采用BCA法(試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供)測定BALF中TP含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

3.肺組織中AngⅡ含量測定:將右肺上葉置于裂解液中，用組織勻漿機打碎后離心，取上清液用ELISA法檢測肺組織中AngⅡ含量(試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司)，嚴格按試劑盒說明書進行操作。在酶標儀(wellscan Mk3，芬蘭)上測出標準品吸光度后繪制出標準曲線，然后根據(jù)測得的樣品吸光度數(shù)值在標準曲線上讀出樣品含量。

4.肺組織Cav-1表達測定:采用免疫組織化學法(SABC)測定肺組織Cav-1的表達。嚴格參照試劑盒說明書(試劑盒購自Cell Signaling Technology)進行操作。兔抗大鼠抗體工作濃度為1︰800，以磷酸鹽緩沖液(phosphate duffer sdution，PBS)代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷:細胞膜呈棕黃色為陽性染色。在400倍光學顯微鏡下對每張組織切片隨機選取5個視野進行觀察，用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野的光密度值，取上述5個視野的平均光密度值作為該組大鼠肺組織Cav-1表達的相對含量。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、肺組織病理學改變

HE染色光學顯微鏡下觀察，對照組大鼠各級支氣管上皮和肺泡結(jié)構完整，肺泡間隔正常，肺間質(zhì)無炎性細胞浸潤。H-VT組大鼠可見大量炎性細胞浸潤和彌漫性肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有血性液體且有炎性細胞浸潤。CAP組大鼠肺也可見到炎性細胞浸潤和肺泡間隔增厚，但較H-VT組明顯減輕(圖1～3)。

圖1 對照組大鼠肺泡結(jié)構完整，肺泡間隔基本正常(HE×250)

圖2 H-VT組大鼠肺泡間隔彌漫性水腫、增厚，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有血性液體滲出及炎性細胞浸潤(HE×250)

圖3 CAP組大鼠肺泡間隔度輕度水腫、增厚，少部分肺泡破裂融合，肺泡腔見少量炎性細胞浸潤(HE×250)

二、肺組織W/D比值測定結(jié)果

各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，與對照組相比，H-VT組和CAP組大鼠肺組織W/D比值均明顯升高(均P＜0.01)，但CAP組大鼠肺組織W/D比值較H-VT組明顯減低(P＜0.01)。

表1 各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠肺組織W/D比值測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n W/D 比值對照組84.0625 ±0.27322 H-VT 組 8 7.1875 ±0.34112a CAP 組 8 4.8913 ±0.43927ab

三、BALF中TP含量測定結(jié)果

各組大鼠BALF中TP含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，與對照組相比，H-VT組和CAP組大鼠BALF中TP含量均明顯升高(均P＜0.01)，但CAP組大鼠BALF中TP含量較H-VT組明顯減低(P＜0.01)。

表2 各組大鼠BALF中TP測定結(jié)果(±s)

表2 各組大鼠BALF中TP測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n BALF中TP 含量對照組80.2238 ±0.03662 H-VT 組 8 0.5413 ±0.05463a CAP 組 8 0.4550 ±0.06568ab

四、肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果

各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，CAP組和對照組大鼠肺組織AngⅡ含量相比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但H-VT組大鼠肺組織AngⅡ含量均明顯高于對照組和CAP組(均P＜0.01)。

表3 各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果(±s)

表3 各組大鼠肺組織AngⅡ含量測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n 肺組織AngⅡ含量對照組8116.7500 ±11.39078 H-VT 組 8 376.0100 ±21.43080a CAP 組 8 132.2563 ±14.35712ab

五、肺組織Cav-1表達水平測定結(jié)果

各組大鼠肺組織Cav-1表達水平測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，H-VT組Cav-1表達水平均明顯低于對照組和CAP組(均P＜0.01)，CAP組大鼠肺組織 Cav-1表達水平低于對照組(P＜0.01)，(圖4～6)。

表4 各組大鼠肺組織Cav-1表達量測定結(jié)果(±s)

表4 各組大鼠肺組織Cav-1表達量測定結(jié)果(±s)

注:與對照組比較:aP＜0.01，bP＜0.01

組 別 n Cav-1表達量對照組80.55625 ±0.039856 H-VT 組 8 0.27875 ±0.048544a CAP 組 8 0.43688 ±0.06312ab

圖4 對照組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

圖5 H-VT組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

圖6 CAP組大鼠肺組織Cav-1(SABC×400)

六、肺組織Cav-1與AngⅡ含量的相關性分析各組大鼠肺組織Cav-1與肺組織AngⅡ含量之間呈負相關(r= －0.821，P＜0.01)。

討 論

近年來通過對信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細胞膜上存在直徑約50～100 nm的囊性凹陷結(jié)構—小窩(caveolae)，其不僅參與跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運，而且是細胞信號分子富集和信號轉(zhuǎn)導的樞紐［3］。小窩蛋白(caveolae pratein)是小窩的主要結(jié)構蛋白和活性成分，其中cav-1廣泛存在于肺組織中［4］。研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1通過其“腳手架”域與多種下游信號轉(zhuǎn)導分子相互作用，調(diào)節(jié)其活性狀態(tài)。當細胞受到適宜刺激后，Cav-1隨即激活，與其相耦聯(lián)的下游信號轉(zhuǎn)導分子產(chǎn)生一系列生物學效應［3］。

有研究表明，Cav-1通過中性粒細胞介導的炎癥反應參與急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，CO在機械通氣過程中發(fā)揮的抗炎保護作用部分是通過誘導Cav-1高表達實現(xiàn)的［1］。與野生型小鼠相比，Cav-1基因敲除小鼠在機械通氣后肺組織損傷程度明顯加重，其支氣管肺泡灌洗液中的蛋白含量和細胞計數(shù)比野生型小鼠升高3～5倍。因此我們推測，Cav-1在機械通氣過程中可能通過調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導分子的活性，參與VILI的發(fā)病過程，但其具體作用機制尚不清楚。

近年來，腎素 －血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)在急性肺損傷中的作用引起了人們的廣泛關注，其中以AngⅡ及其1型受體的作用最為突出［5-9］。研究發(fā)現(xiàn)，大潮氣量機械通氣所致急性肺損傷與RAS系統(tǒng)激活有關，使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑均可減輕肺損傷程度，但RAS系統(tǒng)激活是否與Cav-1信號通路有關目前尚無定論［5］。

本實驗研究顯示:H-VT組大鼠肺組織AngⅡ含量、肺組織W/D比值及BALF中TP含量均明顯高于對照組，而肺組織Cav-1的表達水平明顯低于對照組，且大鼠肺組織中Cav-1表達水平與AngⅡ含量之間呈負相關。說明AngⅡ可通過下調(diào)Cav-1在肺組織中的表達水平，在VILI發(fā)病機制中起一定作用。其作用機制可能是機械牽拉刺激使肺組織血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性升高，生成大量AngⅡ，后者通過某種信號轉(zhuǎn)導通路下調(diào)Cav-1的表達水平，從而使Cav-1對其相耦聯(lián)的下游信號轉(zhuǎn)導分子的抑制作用減弱，最終激活多種炎性細胞并產(chǎn)生大量致炎因子，導致肺組織的損傷。

卡托普利屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性，減少AngⅡ的生成，可減輕由AngⅡ所引起的肺組織炎癥反應。本實驗結(jié)果顯示，CAP組大鼠肺組織病理損傷程度較H-VT組明顯減輕，同時其肺組織AngⅡ含量、肺組織W/D比值、BALF中TP量均較H-VT組明顯降低，而肺組織Cav-1的表達水平較H-VT組明顯增加。說明卡托普利可通過抑制AngⅡ生成，進而上調(diào)Cav-1的表達水平，對VILI具有一定保護作用。

綜上所述，機械刺激可使肺組織AngⅡ生成增多，后者通過下調(diào)肺組織Cav-1的表達水平參與VILI的發(fā)病過程?？ㄍ衅绽ㄟ^抑制AngⅡ生成，上調(diào)肺組織Cav-1的表達水平，對VILI具有一定的防治作用。但AngⅡ通過何種信號轉(zhuǎn)導途徑來調(diào)控肺組織Cav-1的表達水平尚有待深入研究。

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