李翔 李娟 張靜 王桃 楊東梅 王超

青光眼(glaucoma)是一類以特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的眼病。探討青光眼視神經(jīng)損傷的作用機(jī)制,有助于保護(hù)視功能。本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈法誘導(dǎo)產(chǎn)生眼壓維持穩(wěn)定、持續(xù)時間較長的慢性高眼壓動物模型[1],通過觀察補(bǔ)腎活血中藥(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)對EIOP大鼠眼壓及視神經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophin factor,BDNF)表達(dá)的影響,探討其保護(hù)視功能的作用機(jī)理,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

標(biāo)準(zhǔn)1級SD大鼠30只,雌雄不拘,8～12周齡,體重約150～200g,等價飼料飼養(yǎng),大鼠及飼料均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環(huán)。自由攝食飲水。納入標(biāo)準(zhǔn):①無外眼疾病;②雙眼瞳孔直接對光反射和間接對光反射正常;③無歪頸。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方丹參片(批號7122426)、杞菊地黃丸(批號7072153)均購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠。BDNF多克隆抗體(批號BA0565),購于博士倫生物工程有限公司。

1.3 造模方法

SD大鼠購回后,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,進(jìn)行眼壓測量,正常眼壓區(qū)間估計,取平均眼壓在9～18mmHg者,隨機(jī)分為空白組、模型組、給藥組,模型組和給藥組進(jìn)行單眼(右眼)造模,左眼不做處理。方法如下:大鼠稱重及固定后,用3%戊巴比妥鈉按1.5ml/kg體重行左下腹腔注射全身麻醉,同時術(shù)眼予0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液角結(jié)膜表面麻醉,于10點(diǎn)至2點(diǎn)鐘位距角鞏膜緣1～2mm剪開上方球結(jié)膜,分離筋膜,暴露角鞏膜緣后3～4mm近赤道部10點(diǎn)、12點(diǎn)和1點(diǎn)處3支上鞏膜靜脈并烙閉,整復(fù)球結(jié)膜,術(shù)眼涂金霉素眼膏,待大鼠蘇醒后放回籠內(nèi),0.25%氯霉素眼液滴眼,2次/日,連續(xù)6天。假手術(shù)組(空白組)右眼眼科手術(shù)止血器不開開關(guān)而不起烙閉作用,其余操作相同。因為灌胃等原因動物死亡4只。

1.4 分組與給藥方法

將以上各組大鼠連續(xù)給藥8周,方法如下:空白組、模型組每天予3ml生理鹽水灌胃;給藥組每天灌胃予0.96g/kg體重的復(fù)方丹參片、3.0g原生藥/kg體重的杞菊地黃丸的混懸液,相當(dāng)于20倍成人劑量;每天同一時間灌胃1次,連續(xù)灌胃8周。每2周稱大鼠體重1次,調(diào)整給藥量。

1.5 眼壓檢測

均在每天的同一時間(2:00pm～5:00pm)進(jìn)行。待測眼鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后,用TONO-PEN筆式眼壓計連續(xù)測量術(shù)前3天眼壓,取平均值作為正常眼壓;術(shù)后即刻、術(shù)后一周、術(shù)后二周、術(shù)后四周、術(shù)后六周、術(shù)后八周各測一次大鼠右眼眼壓,共8周。

1.6 BDNF免疫組化檢測

于造模8周后以頸椎脫臼法處死大鼠,切取后極部包括視乳頭和視神經(jīng)在內(nèi)的組織塊,立即放入復(fù)合固定液(75%酒精850ml、10%甲醛100ml、5%醋酸50ml混合液)中,固定72h后,標(biāo)本逐級酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,于球后2～4mm處,做4μm連續(xù)切片,烘干備用。染色步驟:所用抗體為大鼠BDNF多克隆抗體;石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5～10min;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min;5-10%的正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10min,傾去血清,勿洗,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37℃孵育1-2h;PBS沖洗,5min×3次;滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10～30min;PBS沖洗,5分鐘×3次;滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酬酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBST稀釋),37℃孵育10～30min;PBS沖洗,5分鐘×3次;顯色劑顯色(DAB或AEC);自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。大鼠BDNF多克隆抗體進(jìn)行BDNF免疫組化染色,結(jié)果判定及半定量分析:BDNF染色的組織內(nèi)出現(xiàn)細(xì)顆粒狀、細(xì)絲狀棕黃色著色為BDNF陽性染色。每張切片隨機(jī)選3個視野,每組共18個視野,用 Mias-2000型圖形圖像分析儀測量視神經(jīng)部位BDNF陽性染色灰度,求取每視野均值代表該切片的測量值,分別表示BDNF的表達(dá)強(qiáng)度。

2 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(見表1):

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較±s)(單位:mmHg)

Note:與造模前相比,△P<0.01;與空白組相比,▲P<0.01

由表1可見:造模前各組大鼠IOP相比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),造模后即刻,模型組和給藥組與空白組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義,說明造模成功(P<0.01),而模型組和給藥組眼壓之間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有組間均衡性;用藥后8周,模型組、給藥組與空白組及造模前眼壓比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),表明高眼壓維持良好,模型組與給藥組眼壓比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但給藥組有降低趨勢。

3.2 補(bǔ)腎活血中藥對EIOP大鼠視神經(jīng)BDNF表達(dá)的影響(見表2):

表2 各組大鼠視神經(jīng)BDNF表達(dá)比較

Note:與空白組相比,▲P<0.05;與模型組相比,△P<0.05

圖1 空白組BDNF染色 圖2 模型組BDNF染色 圖3 給藥組BDNF染色

由表2、圖1-3表可見:造模后,大鼠視神經(jīng)BDNF表達(dá)總面積、平均光密度、積分光密度均顯著降低(P<0.05)。而給予補(bǔ)腎活血中藥后,BDNF表達(dá)總面積、平均光密度、積分光密度均有所恢復(fù),與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示慢性EIOP引起大鼠視神經(jīng)的BDNF表達(dá)減少,補(bǔ)腎活血中藥可對BDNF表達(dá)恢復(fù)有作用。

4 討論

青光眼是一個多因素疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。但是不管發(fā)病機(jī)制是什么,最終導(dǎo)致青光眼視功能損害的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的進(jìn)行性凋亡及視神經(jīng)纖維的丟失[2],臨床中即使眼壓控制到正常范圍,視野缺損和RGCs的凋亡仍在繼續(xù),因此視神經(jīng)的保護(hù)很重要。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophin factor,BDNF)是一種具有抑制神經(jīng)元死亡功能的堿性蛋白質(zhì),與神經(jīng)元的發(fā)育、分化、正常存活與功能表達(dá)、程序化死亡等有關(guān);可促進(jìn)受損神經(jīng)元的存活與再生,還可預(yù)防或改善某些神經(jīng)元的病理過程[3]。BDNF是神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一,有很強(qiáng)的刺激和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長、分化,促使損傷細(xì)胞修復(fù)作用。BDNF還能促進(jìn)神經(jīng)元突起的可塑性,例如增加突起的密度,促進(jìn)包括軸突和樹突在內(nèi)的突起生長[4],除廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和感覺神經(jīng)及骨髓運(yùn)動神經(jīng)元,BDNF主要在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層、內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)纖維層中表達(dá),大部分由視網(wǎng)膜自身分泌,對RGCs的存活起重要作用。目前對于RGCs凋亡的認(rèn)識中已得到廣泛認(rèn)同的一個誘發(fā)因素就是神經(jīng)營養(yǎng)因子,尤其是BDNF的剝奪[5]。當(dāng)視神經(jīng)損傷后,RGCs本身存在保護(hù)性反應(yīng),其表現(xiàn)之一就是BDNF及其受體的表達(dá)增高。所以,選擇視神經(jīng)部位的BDNF表達(dá)作為觀察指標(biāo)對說明視功能保護(hù)的機(jī)理具有一定的作用。

青光眼屬中醫(yī)“五風(fēng)內(nèi)障”范疇,其視功能損害導(dǎo)致的特異性視神經(jīng)萎縮和視野缺損類似于“青盲”,我們的前期研究已經(jīng)從視網(wǎng)膜、視中樞角度觀察了補(bǔ)腎活血對青光眼視功能保護(hù)的作用及機(jī)理,結(jié)果顯示:補(bǔ)腎活血中藥(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)可以抑制EIOP大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(retinal ganglion cells layer,RGCL)變薄,改善RGCs超微結(jié)構(gòu),防止RGCs和RNFL損害,有助于多焦視網(wǎng)膜電圖(multifocal electroretinogram,mfERG)總波及1、2、3、4環(huán)P1波反應(yīng)密度、總波P1波峰潛時、2環(huán)及3環(huán)N1波反應(yīng)密度,3環(huán)、4環(huán)N1波峰潛時的恢復(fù)[6,7],上調(diào)RGCs抗凋亡基因Bcl-2、抑制凋亡促進(jìn)基因Bax[8],并可修復(fù)初級視皮質(zhì)(primaryvisualcortex,PVC)及外側(cè)膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)的損傷,提高EIOP大鼠PVC及LGN的BDNF表達(dá)[9,10]。臨床觀察也發(fā)現(xiàn),加用補(bǔ)腎活血中藥(杞菊地黃丸和復(fù)方丹參片合用)后,青光眼患者的視功能可以得到不同程度的改善[11,12]。

本研究通過觀察慢性EIOP大鼠視神經(jīng)部位的BDNF表達(dá)改變,進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血中藥對青光眼視功能保護(hù)的作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性高眼壓可導(dǎo)致大鼠視神經(jīng)BDNF表達(dá)低下,而補(bǔ)腎活血中藥對模型大鼠視神經(jīng)的BDNF表達(dá)具有恢復(fù)作用,從而對視神經(jīng)起到保護(hù)作用。杞菊地黃丸為經(jīng)典古方,為滋補(bǔ)肝腎明目的代表方劑,復(fù)方丹參片活血化瘀通絡(luò),兩者均為《中國藥典》載入藥品、非處方用藥,價廉物美,服用方便,可作為臨床青光眼視神經(jīng)保護(hù)藥物推廣應(yīng)用。

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