顧士棟，閻 昊，鄒 君，佟繼銘，曹 凱

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎是常用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)研究的動(dòng)物模型之一，其組織病理學(xué)變化和發(fā)病機(jī)制與人類RA相似[1]。赤雹為葫蘆科多年蔓生草本植物，赤雹根為赤雹的干燥成熟塊根，味苦性寒，可活血祛淤、清熱解毒，滿族民間用于治療腰腿痛、風(fēng)濕痛、痛經(jīng)、軟組織損傷、瘰疬等[2]。赤雹根總皂苷(total saponins ofThladiantha dubiaroot，TSTDR)是赤雹根主要的有效成分之一，前期研究顯示TSTDR對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛活性[3]。本研究觀察了TSTDR對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎性細(xì)胞因子TNF-α與IL-10含量的影響，探討TSTDR治療RA的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究開發(fā)赤雹根提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 TSTDR，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所藥理毒理實(shí)驗(yàn)室制備;弗氏完全佐劑(FCA)，F(xiàn)5881型，美國(guó)Sigma公司;雷公藤多苷片，安徽新隴海藥業(yè)有限公司;TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒，上海索寶公司。SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機(jī)，德國(guó)Kendro Labrotary公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 雄性SD大鼠(SPF級(jí))60只，體重160-180g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào):SCXK京2009-0007。隨機(jī)選取其中的10只大鼠作為正常對(duì)照組，其余的50只大鼠建立佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，造摸后第18d，采用關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)評(píng)分法計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI值，以AI值≥6為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。成模的50只大鼠隨機(jī)分為模型組，TSTDR低、中、高劑量組和雷公藤多苷組，每組10只大鼠。TSTDR低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予不同劑量的TSTDR:40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，雷公藤多苷組大鼠灌胃給予12mg/kg的雷公藤多苷，正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積的蒸餾水，各組大鼠灌胃時(shí)間均為21d。

1.3 模型制備 每只大鼠于右后足跖皮下注射FCA 0.1ml。致炎后第18d，采用關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)評(píng)分法計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI值:0級(jí)，無紅腫，計(jì)0分;1級(jí)，趾關(guān)節(jié)紅腫，1分;2級(jí)，小趾關(guān)節(jié)及足跖關(guān)節(jié)腫脹，2分;3級(jí)，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹，3分;4級(jí)，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部關(guān)節(jié)腫脹，4分。AI值=非致炎3只肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)之和(最高分為12分)，以AI值≥6為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.4 檢測(cè)大鼠血清TNF-α和IL-10 大鼠給藥結(jié)束后,20ml/L戊巴比妥鈉(2.5ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3500r/min離心10min，取血清采用雙抗夾心ABC-ELISA法，檢測(cè)大鼠血清TNF-α和IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 TSTR對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 TSTDR各劑量組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。見附表。

附表 TSTOR對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和血清細(xì)胞因子的影響(±s，n=10)

附表 TSTOR對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和血清細(xì)胞因子的影響(±s，n=10)

與模型組比較:*P＜0.01，**P＜0.05

組別 劑量(mg/kg)關(guān)節(jié)炎指數(shù) TNF-α(ng/ml)IL-10(ng/ml)正常對(duì)照組 - - 0.15±0.03* 2.60±0.05*模型組 - 7.20±0.32 0.98±0.08 1.91±0.06 TSTDR低劑量組 40 6.00±0.40** 0.56±0.05* 2.92±0.23*TSTDR中劑量組 80 5.10±0.18** 0.32±0.04* 3.06±0.05*TSTDR高劑量組 160 4.20±032* 0.18±0.04* 3.08±0.05*雷公藤多苷組 12 4.30±0.42* 0.15±0.03* 2.83±0.05*

2.2 TSTDR對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-10含量的影響 模型組大鼠血清TNF-α含量明顯高于正常對(duì)照組、IL-10含量明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TSTDR各劑量組大鼠血清TNF-α含量明顯低于模型組(P＜0.01);TSTDR各劑量組大鼠血清IL-10含量明顯高于模型組(P＜0.01)。見附表。

3 討論

RA是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的全身性自身免疫性疾病，以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié)，反復(fù)發(fā)作，呈對(duì)稱分布。RA早期出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫熱痛和功能障礙，繼而導(dǎo)致軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄，晚期關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎縮，影響肢體功能而致殘[1]。

TNF-α是RA發(fā)病機(jī)理中居中心地位的炎癥性細(xì)胞因子，參與RA的發(fā)生發(fā)展過程，可刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成PEG2和膠原酶，導(dǎo)致骨和軟骨的吸收破壞，促進(jìn)成纖維母細(xì)胞增生，抑制骨膠原合成。文獻(xiàn)報(bào)道，RA模型大鼠炎癥組織中有大量TNF-α和IL-1β的表達(dá)，是引起大鼠關(guān)節(jié)腫脹及滑膜損傷的重要因素[5];肖金魚等報(bào)道[6]，RA患者滑液和血清中TNF-α水平顯著增高。有研究顯示，應(yīng)用抗TNF-α單抗治療RA患者，患者的癥狀、體征明顯減輕，病變關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜炎和軟骨破壞得以抑制[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，TSTDR可明顯降低RA大鼠血清TNF-α含量，提示TSTDR可能通過抑制TNF-α的產(chǎn)生發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。

IL-10是一種具有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用的細(xì)胞因子，可通過抑制HLA-DR、IL-1、TNF-α及GMGSF的產(chǎn)生達(dá)到抗炎作用，IL-10含量減少在RA的發(fā)病中具有一定作用。范雪亮等[8]應(yīng)用ELISA法檢測(cè)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清IL-10的水平，結(jié)果顯示模型大鼠血清IL-10水平明顯低于對(duì)照組，表明關(guān)節(jié)炎大鼠模型IL-10的分泌受到了抑制。本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)，模型組大鼠血清TNF-α含量顯著升高、IL-10含量顯著降低;經(jīng)TSTDR治療后，TSTDR高、中、低劑量組大鼠血清IL-10含量均明顯高于模型組。

本研究表明，TSTDR可通過降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清促炎性細(xì)胞因子TNF-α的含量、提高炎性抑制細(xì)胞因子IL-10的含量，抑制骨滑膜組織增生，減輕軟骨和骨破壞，可能是TSTDR治療RA的作用環(huán)節(jié)之一。

[1]許赤多，戴冽，湯美安.大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)及觀察指標(biāo)比較[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2002，18(2):140-141.

[2]宋立人，紅恂，丁緒亮，等.現(xiàn)代中藥大辭典[M].上冊(cè).北京:人民衛(wèi)生出版社，2001.1022.

[3]張玉玲，趙波，陳建雙，等.赤雹根鎮(zhèn)痛作用及有效部位研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(10):2483-2484.

[4]吳虹，陳尹，魏偉，等.梔子總苷對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎治療作用及部分機(jī)制的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(11):49-52.

[5]Kawahito Y, Kondo M, Tsubouchi Y, et al.15-deoxy-delta(12,14)-PGJ(2)induces synoviocyte apoptosis and suppresses adjuvantinduced arthritis in rats[J].J Clin Invest, 2000, 106(2): 189-197.

[6]肖金魚，王炳勝，王書杰.IL-1及TNF-α在關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20(4):607-608.

[7]Zhang HG, Huang N, Liu D, et al.Gene therapy that inhibits nuclear translocation of nuclear factor kappaB results in tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis of human synovial fibroblasts[J].Arthritis Rheum, 2000, 43(5): 1094-1105.

[8]范雪亮，肖金魚.關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表達(dá)的檢測(cè)[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20(7):1102，1127.