李 穎 尹茂山 官 娟 周佩佩 劉 菲 徐曉燕

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

丹皮為毛莨科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，是中醫(yī)臨床常用的中藥之一。丹皮總苷(total glucosides of Mudan cortex，TGM) 系牡丹皮中重要活性成分,主要包括芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷、丹皮原苷、丹皮新苷等苷類化合物?，F(xiàn)代藥理認(rèn)為，丹皮提取物具有降血糖、抗變態(tài)、抑制動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗腫瘤、抗菌抗炎等作用[1-4]。有資料提示丹皮可顯著保護(hù)心肌細(xì)胞，本研究將通過垂體后葉素復(fù)制急性心肌缺血模型，進(jìn)一步研究丹皮總苷的抗心肌缺血作用，為丹皮的臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 牡丹皮，中藥飲片，購自泰安市金泰聯(lián)醫(yī)藥公司；垂體后葉素，上海禾豐制藥有限公司，批號：100701；肌酸激酶(CK)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20110411；乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20110411；考馬斯亮蘭蛋白測試盒，南京建成生物工程研究所，批號：20110411；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所。

1.2儀器 SHB-95A型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司； BL-410生物機(jī)能實驗儀，成都泰盟儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；S-54紫外分光光度儀，上海校光技術(shù)有限公司；Bio-rad680酶標(biāo)儀。

1.3動物 昆明種小鼠，雌雄兼用，體重18～25克，由泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.4方法

1.4.1丹皮總苷的提取、純化和含量測定[5]生藥材除去雜質(zhì)后切片，將牡丹皮片與定量乙醇溶液拌勻浸潤(料液比1∶5，加入75%乙醇)，待10小時后，全部放置于配有回流冷凝裝置的圓底燒瓶里，微沸回流60 min，真空濾過取溶液，重復(fù)3次以上操作合并溶液。經(jīng)過D-101大孔樹脂純化，收集經(jīng)過純化的溶液，置水浴鍋上濃縮成膏狀，保持干燥放置。以芍藥苷為標(biāo)準(zhǔn)品，10%變色酸為顯色劑，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得所提取的丹皮總苷的含量為74.65%。

1.4.2動物分組及給藥 將小鼠60只隨機(jī)分成5組，分別為正常組、模型組、丹皮總苷低、中、高劑量組。丹皮總苷低、中、高劑量組分別給予丹皮總苷50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg；正常組及模型組給予等容量蒸餾水，1次/天，連續(xù)1周。末次給藥30 min后腹腔注射烏拉坦1.3 g/kg麻醉，用BL-410生物機(jī)能實驗系統(tǒng)描記小鼠標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ正常心電圖，正常組小鼠腹腔注射等容量的生理鹽水，其余組小鼠腹腔注射垂體后葉素60 U/kg。連續(xù)記錄腹腔注射垂體后葉素后20 min心電圖，觀察并比較給藥后心肌缺血小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖J點電壓變化，并以PR段為基線記錄各組小鼠J點位移(mV)及T波的位移變化。J點高度測量以PR段為基線，每時間點測3個連續(xù)的波型，取其平均值[6-7]。

1.4.3生化指標(biāo)的檢測 造模20 min后摘眼球取血，血樣靜置30 min后，3000 r/min離心，取血清測定CK。處死小鼠取心臟，用生理鹽水洗凈殘留的血液，濾紙吸干稱重，以生理鹽水為勻漿介質(zhì)制成5%的組織勻漿，冰浴操作，然后3600 r/min離心10 min，取上清液。再用生理鹽水稀釋成所需要的濃度，測定心肌組織LDH活力。

1.4.4Nagar-Olsen染色觀察心肌病理改變[11]常規(guī)脫蠟入水，入明礬蘇木素液10～30 s，蒸餾水洗，堿性復(fù)紅染液浸染3 min，蒸餾水、丙酮依次洗滌，0.1%苦味酸丙酮液分化5～10 s。丙酮脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié) 果

2.1丹皮總苷對心肌缺血小鼠心電圖改變的影響

2.1.1丹皮總苷對心肌缺血小鼠心電圖T波的影響 腹腔注射垂體后葉素后10、20 min時，模型組小鼠T波較正常組有明顯位移，位移幅度超過0.1 mV(P<0.05)。與模型組相比，丹皮總苷高劑量組能對抗注射垂體后葉素所致的T波位移，位移幅度超過0.1 mV(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 丹皮總苷對急性心肌缺血小鼠心電圖T波位移的影響

注： 與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.1.2丹皮總苷對心肌缺血小鼠心電圖J點的影響 腹腔注射垂體后葉素后10、20 min時， 較正常組相比，模型組小鼠心電圖J點較正常組有明顯位移，位移幅度超過0.1 mV。與模型組相比，丹皮總苷高劑量組能顯著降低心電圖J點的位移，位移幅度超過0.1 mV(P< 0.05 )。結(jié)果見表2。

表2 丹皮總苷對急性心肌缺血小鼠心電圖J點位移的影響

注： 與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2丹皮總苷對心肌缺血小鼠CK的影響 在本實驗中，與正常組相比，模型組小鼠的血清中CK含量上升(P<0.01)；與模型組相比，而丹皮總苷高劑量組中CK含量明顯降低。結(jié)果見表3。

2.3丹皮總苷對心肌缺血小鼠心肌組織中LDH的影響 與正常組相比，模型組小鼠的心肌組織中LDH含量升高(P<0.05)；與模型組相比，丹皮總苷高劑量組的心肌組織中LDH明顯降低。結(jié)果見表4。

表3 丹皮總苷對小鼠急性心肌缺血小鼠血清中CK含量的影響

注： 與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

表4 丹皮總苷對小鼠急性心肌缺血心肌組織中LDH的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.05。

2.4丹皮總苷對心肌組織Nagar-Olsen染色變化的影響 光學(xué)顯微鏡下可見，正常對照組心肌組織呈黃染，模型組缺血心肌呈紅染。與模型組相比，高劑量丹皮總苷組心肌紅染面積顯著減少，黃染面積增多；而低劑量丹皮總苷組雖有部分組織黃染，但仍可見大片紅染的心肌組織。

3 討 論

垂體后葉素能直接使小動脈及冠狀動脈收縮，血壓升高，造成心肌缺血缺氧；同時收縮全身毛細(xì)血管，導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，耗氧增強(qiáng)，近年來已廣泛應(yīng)用于篩選抗心肌缺血藥物的研究[8-9]。CK 的活力可作為評價心肌細(xì)胞損害程度的重要指標(biāo)。心肌缺血或心肌受損時，導(dǎo)致缺血心肌CK 的釋放，心肌組織CK活性越高，表明心肌損傷越嚴(yán)重。研究[10]顯示，在急性心肌梗死發(fā)生早期，心肌細(xì)胞缺血、缺氧，氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失，生成系統(tǒng)潛在活性增大，一旦恢復(fù)血供與氧供，氧自由基便爆發(fā)性產(chǎn)生并急劇堆積，以不同方式造成細(xì)胞慢性和急性損傷，造成膜流動性增加，破壞膜結(jié)構(gòu)完整性，細(xì)胞內(nèi)LDH大量漏出，引起心肌組織LDH的升高。因此， LDH的高低可以用來作為判斷細(xì)胞損傷的指標(biāo)。常規(guī)的HE染色很難分辨心肌缺血的早期改變， Nagar-Olsen染色可以將缺血早期的心肌染成紅色，從而分辨心肌缺血的早期改變，其原理為:缺血心肌對復(fù)紅液的著色力較強(qiáng)，分化時不易脫色[11]。故缺血損傷的心肌組織呈紅色；而正常心肌對分化液的抵抗力差，易脫色，故呈黃色或黃棕色。

本實驗?zāi)Ｐ徒M小鼠心電圖J點和T波都有明顯位移提示心肌缺血模型塑造成功。研究結(jié)果提示，丹皮總苷能改變垂體后葉素所致心肌缺血小鼠的心電圖J點位移和T波的變化，明顯降低血清中CK和心肌組織中LDH含量，減少小鼠心肌缺血損傷紅染面積，提示對急性心肌缺血小鼠具有保護(hù)作用。

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