苗婷婷，張建平，宮汝淳，何曉燕，趙玉敏，喬淑芬

(通化師范學院 生命科學學院，吉林 通化134002)

東北雷公藤(TripterygiumregeliiSpragueetTakeda)為衛(wèi)矛科雷公藤屬多年生草本植物，為野生藥用植物[1]，分布于東北三?。涔δ苤饕獮殪铒L除濕，解毒殺蟲，利水消腫，外用治風濕性關節(jié)炎.該物種為中國植物物種編目數(shù)據(jù)庫收錄的有毒植物，其毒性為全株有毒.隨著東北雷公藤研究的不斷深入及其廣泛的研發(fā)應用，僅20余年的時間，其資源就已經(jīng)大幅減少甚至面臨枯竭.東北雷公藤在我國研究的已經(jīng)比較廣泛，但多見于對其藥效及臨床上的研究，對毒副作用的病理學研究較少，東北雷公藤對組織學的影響更是少見報道，本實驗通過白細胞計數(shù)和制作組織切片，觀察東北雷公藤對小鼠白細胞數(shù)目及肝組織結構的影響，以期為病理學研究、有效開發(fā)及臨床應用提供可靠的理論依據(jù)，對今后研究降低或消除其毒性提供依據(jù).

1 實驗材料

1.1 實驗動物

小鼠100只，體重(25±2)g，雄性，購于長春市高新經(jīng)濟動物養(yǎng)殖中心.

1.2 實驗藥品

東北雷公藤于秋季采自吉林省通化市通化師范學院后山，并經(jīng)鑒定.注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，四氯化碳(湖南師大化學試劑廠)，其它試劑均為分析純試劑.

1.3 實驗儀器

中藥粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司，F(xiàn)W100)，顯微圖像分析儀(德國萊卡，M165C-3D)，數(shù)字冰凍切片機(德國萊卡3050S)，索氏提取器等.

2 實驗過程

2.1 藥物提取及試劑配制

稱取東北雷公藤130g，粉碎后放入大燒杯中用95%乙醇，以固液比1g:10ml浸提．浸泡3次，4h/次，得到粗提液[2].將粗提液置于索氏提取器中用95%乙醇以3倍體積百分數(shù)回流3次，每次2h，過濾，合并3次濾液.將合并濾液置于分液漏斗中，用正丁醇進行萃取，150ml/次.電磁爐加熱2h，揮盡正丁醇，冷卻后得到黃色晶體，純化后產(chǎn)品重量為2.38g，分別根據(jù)東北雷公藤3個實驗組小鼠不同給藥量(1.2mg/kg、2.4mg/kg、3.6mg/kg)精密稱取0.3g、0.6g、0.9g提純產(chǎn)品，溶于蒸餾水配制成30ml溶液，即濃度為10g/L、20g/L、30g/L的中藥混合提取液.

2.2 實驗方法

(1)小鼠白細胞數(shù)目的測定.取50只小鼠，隨機分為5組，每組10只，分別是：正常組，環(huán)磷酰胺組，東北雷公藤高濃度組、中濃度組、低濃度組.實驗前小鼠適應性喂養(yǎng)7d，給藥前禁食12h，自由飲水，給藥后禁食4h.

正常組不做處理，正常喂養(yǎng)7d.環(huán)磷酰胺組在第6天腹腔注射環(huán)磷酰胺300mg/(kg·d)，用生理鹽水稀釋.每只小鼠注射0.2ml，觀察24h.東北雷公藤高、中、低濃度組(給藥濃度分別為10g/L、20g/L、30g/L)用事先提取好的中藥混合提取液進行灌胃，每天1次，每次0.2ml，持續(xù)7d.第7d后，用頸椎脫臼法把各組小鼠處死，收集心臟中血液.用吸管分別吸取各組血液0.02ml，放入0.38ml白細胞稀釋液中，擦凈吸管外沾附的血液，并用上清液吸洗吸管2～3次，搖勻.將白細胞混懸液滴入計數(shù)池內(nèi)，靜置2～3min，待白細胞下沉后計數(shù).在低倍鏡下觀察，白細胞呈圓形，漿透亮，核呈紫黑色，稍有折光，借此特點可與雜質相區(qū)別.計數(shù)：計數(shù)池四角的4個大方格中所有的白細胞數(shù)，將總數(shù)乘以50，即得每立方毫米的白細胞數(shù).

(2)小鼠肝組織切片的制備.取50只小鼠，隨機分為5組，每組10只，分別是：正常組，四氯化碳組，高濃度組、中濃度組、低濃度組.正常組及實驗組的處理方法同(1).四氯化碳組在第6d腹腔注射0.1%(v/v)四氯化碳花生油溶液10ml/kg，構建小鼠急性肝損傷模型[3].禁食，不禁水．第7d后，用頸椎脫臼法將各組小鼠處死，收集肝臟，用4%甲醛固定24h，用數(shù)字冰凍切片機切片，再將切片染色，用顯微圖像分析系統(tǒng)進行觀察分析．

3 結果與分析

3.1 東北雷公藤對小鼠一般特征的影響

與正常組比較，環(huán)磷酰胺和四氯化碳組腹腔注射24h后，小鼠活動度減低，反應遲鈍，食量減少，眼角分泌物增多．實驗組給藥7d后，低濃度組與正常組比較無明顯變化；中濃度組小鼠毛松散，活動度降低；高濃度組小鼠反應遲鈍，食量減少甚至拒食，眼角分泌物增多，第7d小鼠出現(xiàn)抽搐、昏迷、死亡現(xiàn)象．

3.2 東北雷公藤對小鼠白細胞數(shù)目的影響

在顯微鏡下觀察，與正常組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠白細胞數(shù)目顯著下降(P<0.01)，東北雷公藤3個濃度組白細胞數(shù)目：低濃度組沒有明顯變化；中濃度組白細胞數(shù)目低于正常組(P<0.05)，接近環(huán)磷酰胺組；高濃度組的白細胞數(shù)目明顯低于正常組(P<0.01)，低于環(huán)磷酰胺組(P<0.05)．

表1 東北雷公藤對白細胞數(shù)目的影響

與正常組比較，﹡表示差異顯著(P<0.05)，﹡﹡表示差異極顯著(P<0.01)．

3.3 東北雷公藤對小鼠肝組織結構的影響

由圖1可以看出，正常組肝細胞形態(tài)結構正常，細胞核染色較淺，核質分布均勻，中央靜脈清晰可見，肝索呈放射狀排列規(guī)則，肝小葉結構清晰．四氯化碳組肝細胞排列紊亂，肝小葉界限不清晰，可見四氯化碳對肝臟造成了非常嚴重的損傷．東北雷公藤各濃度組肝臟均有不同程度的病變，核大小不一，部分皺縮，肝竇內(nèi)可見崩解的核碎片及壞死細胞的殘骸，細胞竇面及毛細膽管面微絨毛輕度腫脹．

4 討論

東北雷公藤與雷公藤是同屬植物，功效相似，有劇毒．經(jīng)研究雷公藤對血液系統(tǒng)的損害主要表現(xiàn)為減少紅細胞、白細胞和血小板，本實驗結果與此相符．肝臟是哺乳動物最大的消化腺，其最重要的生理功能就是解毒，血液從消化道帶來的一些有毒物質都可在肝臟中經(jīng)氧化過程等減輕毒性，而雷公藤提取物具有強烈毒性，在進入體內(nèi)消化的過程中不能被肝臟有效的進行分解，并對肝臟造成損傷，濃度越高造成的損傷程度越嚴重[4]．我們的實驗結果與此相似，說明東北雷公藤中的毒性物質可以對小鼠的肝臟造成損傷．

a 正常組 b 低濃度組 c 中濃度組 d 高濃度組 e 四氯化碳組

圖1肝組織顯微結構(10×10)

參考文獻：

[1]喬淑芬，李杰，顧地周，等.基于均勻設計法評價東北雷公藤對油松毛蟲的觸殺活性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(28):13669-13670.

[2]林劍鋒，朱慧，鄭友蘭，等.雷公藤內(nèi)酯醇誘導的血栓性淺靜脈炎[J].海峽醫(yī)學，2001，13(3):35-37.

[3]陳雪龍，齊艷萍.四氯化碳急性肝損傷小鼠血清及肝組織學變化[J].中國獸醫(yī)雜志，2011，47(1):39-41.

[4]周琳，馮俊濤，馬志卿，等.雷公藤總生物堿對粘蟲的生物活性[J].植物保護學報，2006，33(4):401-406.