唐 嘉，陳良燕，王 博，邵子鋒，張錦輝，陳 忠

（海南師范大學(xué) 熱帶動(dòng)植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?71158）

文昌雞是海南島優(yōu)秀的地方肉雞品種，因其體型圓小、脛細(xì)短、皮薄肉酥、肉質(zhì)嫩滑、肉味香濃而受到人們的普遍歡迎，已被農(nóng)業(yè)部認(rèn)定為地方家禽品種，并列入國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄［1］。

養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?；l(fā)展使傳染病爆發(fā)的幾率越來(lái)越大［2］?？股厮幬镫m能達(dá)到預(yù)防和治療目的，但由于藥物殘留及人為濫用，極易引發(fā)毒副作用，不僅破壞腸道微生態(tài)平衡，也給人類(lèi)的健康帶來(lái)潛在的威脅。另一方面，我國(guó)政府提出，在海南島進(jìn)行“非免疫無(wú)疫區(qū)”試驗(yàn)，因此研發(fā)加速畜禽生長(zhǎng)發(fā)育、提高生產(chǎn)性能、增強(qiáng)抗病能力的綠色飼料添加劑，成為當(dāng)前養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟待解決的重要問(wèn)題。

近年來(lái)，大量藥理及臨床研究表明，中藥多糖以其天然性、多功能性、低副作用、低藥殘、無(wú)抗藥性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠提高機(jī)體的生產(chǎn)性能［3］及免疫功能［4-5］。巴戟天是四大南藥之一，其多糖的含量較高，有較高的藥用價(jià)值［6］。研究顯示，巴戟天多糖能使幼年小鼠的胸腺的重量增加，提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和小鼠脾臟免疫特異玫瑰花環(huán)細(xì)胞的形成，從而增強(qiáng)其免疫能力［7］。但由于中藥品種的多樣性，加之受地理環(huán)境、提取工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面的影響，其應(yīng)用效果也不相同。而且目前多糖的研究多側(cè)重于單味中藥多糖以及復(fù)方中藥多糖，關(guān)于多糖與其他新型免疫增強(qiáng)劑復(fù)合物的研究較少。

γ-氨 基 丁 酸 （gamma-aminobutyric acid，GABA）是一種在動(dòng)物體內(nèi)起神經(jīng)鎮(zhèn)定作用的非蛋白質(zhì)氨基酸，主要通過(guò)神經(jīng)元突觸后膜上的GABAA、GABAB、GABAC三種受體介導(dǎo)，參與體內(nèi)多種行為和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)［8-9］。研究表明，GABA具有提高動(dòng)物采食量［10］、刺激生長(zhǎng)激素分泌［11］、抗熱應(yīng)激［12］等作用。GABA還可能通過(guò)解除生長(zhǎng)抑素的抑制作用來(lái)促進(jìn)分泌性免疫球蛋白A（sIg A）的分泌和胃泌素的分泌［13］。最新研究結(jié)果顯示，GABA作為存在于大腦中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)自身免疫性炎癥有良好的抑制作用［14］，且無(wú)任何毒性作用和積蓄效應(yīng)［15］，是一種新型的免疫增強(qiáng)劑。

本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同日齡雛雞生產(chǎn)性能及部分免疫功能的發(fā)育狀況，探究GABA與巴戟天多糖的復(fù)合物（GMP）對(duì)雛雞生產(chǎn)性能及部分免疫功能發(fā)育的影響，為GABA及巴戟天多糖在免疫增強(qiáng)劑方面的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及GABA與巴戟天多糖的復(fù)合物

10只1日齡雄性文昌雞（由海南永基畜牧股份有限公司提供），隨機(jī)分對(duì)照組（CK）、GABA組和GMP組。稱(chēng)重和編號(hào)，組間體重、采食量等無(wú)顯著差異。CK組每日灌喂生理鹽水0.2 m L；GABA組每日灌喂50 mg／kg GABA 溶液0.2 m L［12］；GMP組每日灌喂50 mg／kgGMP溶液0.2 m L。全部雛雞自由飲蒸餾水和采食，飼料、飲水供應(yīng)充足，室內(nèi)自然通風(fēng)與光照，雞舍定期清掃消毒。

GMP由GABA與巴戟天多糖按5：3的比例整合而成。巴戟天多糖的提取采用水提醇沉法［16］，巴戟天根莖與蒸餾水按1：10（W：V）整合，浸泡24h，沸水浴抽提30 min，1000g離心10 min，濾紙過(guò)濾，調(diào)p H至中性，加3倍體積的75%乙醇，靜置過(guò)夜，收集沉淀，干燥保存。GABA為Sigma公司產(chǎn)品，中藥巴戟天（Morinda officinalis How）為湛江逢春制藥有限公司提供。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 生產(chǎn)性能測(cè)定 分別測(cè)定1日齡雛雞初始體重與19日齡雛雞的體重，記錄各組雛雞每日飼料消耗量，試驗(yàn)結(jié)束后分別計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.2.2 免疫器官臟器指數(shù)測(cè)定及組織結(jié)構(gòu)觀察分別在第7、10、13、16、19 d時(shí)，空腹稱(chēng)重，并剖取各組雛雞，無(wú)菌完整摘取胸腺、法氏囊，剔除脂肪組織和結(jié)締組織后準(zhǔn)確稱(chēng)重，記錄濕重，計(jì)算胸腺、法氏囊指數(shù)。免疫器官指數(shù)＝器官濕重（g）／體重（kg）；生理鹽水沖洗組織，置于Bouin＇s液固定，70%酒精沖洗并保存，之后進(jìn)行常規(guī)切片及染色，觀察組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.3 免疫指標(biāo)測(cè)定 在第7、10、13、16、19 d，頸靜脈取抗凝血1 mL，常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)；頸靜脈取非抗凝血2 mL，置4℃冰箱中45°傾斜放置2 h后，3 000 r／min離心10 min，分離血清，免疫比濁法測(cè)定血清溶菌酶含量（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所）；頸靜脈取抗凝血2 mL，2 500 r／min離心20 min，分離血清，常規(guī)Elisa法測(cè)定血清C3蛋白含量（試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技公司）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件的one-way ANOVA進(jìn)行分析，用LSD進(jìn)行各組間多重比較，結(jié)果用ˉx±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMP對(duì)雛雞生產(chǎn)性能的影響

由表1可知，與CK組相比，GABA組與GMP組雛雞平均日增重均升高；平均日采食量、料重比均降低，且料重比差異顯著（P＜0.05）。與GABA相比，GMP組雛雞平均日增重升高，料重比降低。

2.2 GMP對(duì)雛雞中樞免疫器官指數(shù)及顯微組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響

隨著日齡增加，雛雞胸腺臟器指數(shù)逐漸增大，胸腺體積增大，胸腺小葉增多增大，小葉皮質(zhì)變薄，比例相對(duì)減少；髓質(zhì)范圍變大，皮髓質(zhì)界限逐漸模糊，髓質(zhì)內(nèi)胸腺小體增多增大。胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨日齡的增加而增多。由表2知，與CK組相比，GABA與GMP組的胸腺指數(shù)均增大，且GABA組在第19日齡時(shí)達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）。GMP組在第7、19日齡時(shí)達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）；與GABA組相比，GMP組的胸腺指數(shù)仍增大，且在第7日齡達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）。顯微結(jié)構(gòu)方面，由圖1可知，與CK組相比，GABA組及GMP組胸腺體積明顯增大，胸腺小葉數(shù)量增多增大，皮質(zhì)增厚，皮質(zhì)比例增大，髓質(zhì)比例減少。其中GMP組的組織結(jié)構(gòu)變化較GABA組明顯（A、B、C）。

表1 GMP對(duì)文昌雞雛雞生產(chǎn)性能的影響（n＝10）Table 1 Effects of GMP on growth performance of Wenchang chicken（n＝10）

表2 GMP對(duì)文昌雞雛雞中樞免疫器官指數(shù)的影響（n＝10）Table 2 Effects of GMP on the index of central immune organ in Wenchang chicks（n＝10）

圖1 GMP對(duì)文昌雞雛雞胸腺和法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響A，B，C.胸腺組織結(jié)構(gòu)圖；D，E，F(xiàn).法氏囊組織結(jié)構(gòu)圖；A，D.對(duì)照組；B，E.GABA組；C，F(xiàn).GMP組；Bar＝50μmFig.1 Effects of GMP on the structure of thymus and bursa of Fabricius in Wenchang chicksA，B，C.the structure of thymus；D，E，F(xiàn).the structure of bursa of Fabricius；A，D.Control group；B，E.GABA group；C，F(xiàn)；GMP group；Bar＝50μm

隨著日齡增加，雛雞法氏囊指數(shù)逐漸增大，法氏囊濾泡數(shù)量明顯增多，面積明顯增大，濾泡皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界明顯，濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量隨著日齡的增加而增多且排列更加緊密。由表2可知，與CK組相比，GABA組與GMP組的法氏囊指數(shù)均增大，且GMP組分別在第7、13日齡時(shí)達(dá)到顯著差異（P＜0.05）；與GABA組相比，GMP組的法氏囊指數(shù)仍增大，且在第13日齡達(dá)到顯著性差異（P＜0.05）。顯微結(jié)構(gòu)方面，由圖1可知，與CK組相比，GABA組及GMP組法氏囊皺裂增多，體積增大；皺裂內(nèi)法氏囊濾泡數(shù)量增多，體積增大，排列緊密，濾泡皮質(zhì)增厚，皮髓質(zhì)分界明顯。其中GMP組的組織結(jié)構(gòu)變化較GABA組明顯（D、E、F）。

2.3 GMP對(duì)雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)、血清中溶菌酶含量與補(bǔ)體3蛋白含量的影響

由表3可知，隨著日齡增加，雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)上升。與CK組相比，GABA組與GMP組雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)均上升，且GABA組在第7日齡達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），GMP組在第7、10、13日齡時(shí)達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），與GABA組相比，GMP組雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)上升。

由表4知，隨著日齡增加，雛雞血清溶菌酶含量增加。與CK組相比，GABA組與GMP組的雛雞血清溶菌酶含量均增加，且GABA組在第13日齡時(shí)達(dá)到顯著差異（P＜0.05）；GMP組在第10、13日齡時(shí)達(dá)到顯著差異（P＜0.05），與GABA組相比，GMP組雛雞血清溶菌酶含量有一定程度的增加。

表3 GMP對(duì)文昌雞雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)的影響（n＝10）Table 3 Effects of GMP on the amount of leucocytes in chicken peripheral blood（n＝10） ×109／L

表4 GMP對(duì)文昌雞雛雞血清溶菌酶含量的影響（n＝10）Table 4 Effects of GMP on the content of lysozyme in chicken serum（n＝10） U／m L

GMP對(duì)文昌雞雛雞血清補(bǔ)體3蛋白含量影響見(jiàn)表5。由表5知，隨著日齡增加，雛雞血清補(bǔ)體C3蛋白含量增加。與CK組相比，GABA組與GMP組雛雞血清補(bǔ)體C3蛋白含量均有一定程度的上升趨勢(shì)。且GMP組的上升趨勢(shì)較GABA組明顯。

表5 GMP對(duì)文昌雞雛雞血清補(bǔ)體3蛋白含量的影響（n＝6）Table 5 Effects of GMP on the content of complement 3 protein in chicken serum （n＝6） μg／m L

3 討 論

3.1 GMP對(duì)雛雞生產(chǎn)性能的影響

研究顯示，GABA能夠顯著降低熱應(yīng)激肉雞的呼吸頻率和直腸溫度［17］，提高日增重，降低飼料消耗，改善料重比［12］，從而提高生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GABA能夠使雛雞的平均日增重增加，平均日采食量降低，料重比下降，改善其生產(chǎn)性能，與前人的研究成果相符。另一方面，多糖具有抗菌、抗病毒、改善動(dòng)物生產(chǎn)性能等一系列作用。在畜禽飼料中添加酵母多糖［18］、黃芪多糖［19］、脂多糖［20］等可以促進(jìn)生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GMP組雛雞的生產(chǎn)性能高于GABA組，提示巴戟天多糖與GABA存在協(xié)同效應(yīng)。這與朱正生等［21］研究黃芪多糖與GABA的復(fù)合物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能影響的研究結(jié)果一致。但報(bào)道同時(shí)指出，黃芪多糖組與空白組比較差異不顯著，因此推測(cè)，GABA與黃芪多糖復(fù)方對(duì)雛雞的增重效果可能主要由GABA引起。本試驗(yàn)結(jié)果雖然顯示GMP組雛雞的生產(chǎn)性能高于GABA組，但無(wú)顯著性差異，考慮到多糖的提取方式、給藥方式均會(huì)導(dǎo)致多糖的利用效果［22］，加之目前鮮有關(guān)于巴戟天多糖提高雛雞生產(chǎn)性能的報(bào)導(dǎo)。因此關(guān)于此復(fù)方引起雛雞生產(chǎn)性能提高的機(jī)理需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

3.2 GMP對(duì)雛雞免疫功能及組織結(jié)構(gòu)的影響

胸腺和法氏囊是雞的中樞免疫器官。是來(lái)自骨髓的多功能干細(xì)胞繁殖分化成T、B淋巴細(xì)胞的場(chǎng)所，淋巴細(xì)胞在此繁殖不需要抗原刺激，它們向外周免疫器官輸送T、B淋巴細(xì)胞，并決定外周免疫器官的發(fā)育［23-24］。Rivas等［25］研究認(rèn)為胸腺、法氏囊的重量可用于評(píng)價(jià)雛雞的免疫狀態(tài)。免疫器官指數(shù)是反應(yīng)免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。一般認(rèn)為免疫器官重量增加是由于其自身細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分裂增殖所致，為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)；免疫器官重量下降為免疫抑制的表現(xiàn)；免疫指數(shù)的提高表明該器官成熟快。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著發(fā)育的進(jìn)行，雛雞胸腺與法氏囊的臟器指數(shù)增加；胸腺體積增大，胸腺小葉增多，小葉皮質(zhì)變薄，髓質(zhì)變厚，髓質(zhì)內(nèi)胸腺小體增多增大，胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多；法氏囊濾泡數(shù)量增多，面積增大，濾泡皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)變薄，濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多且排列更加緊密。說(shuō)明機(jī)體的免疫機(jī)能增強(qiáng)，且GABA組雛雞中樞免疫器官的臟器指數(shù)與器官發(fā)育程度均高于CK組，說(shuō)明GABA能夠促進(jìn)雛雞中樞免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育和迅速成熟，使雛雞免疫機(jī)能加強(qiáng)，抵抗各種病原微生物感染和抗各種應(yīng)激的能力提高。這與伍應(yīng)松［26］的研究結(jié)果相符。另一方面，GMP組雛雞的中樞免疫器官指數(shù)與器官發(fā)育程度較CK組同樣增大，且作用高于GABA組。考慮到巴戟天多糖也可以提高小鼠免疫器官指數(shù)以及巨噬細(xì)胞的吞噬率［27］，推測(cè)巴戟天多糖可以促進(jìn)雛雞中樞免疫器官的發(fā)育且GABA與巴戟天多糖存在某種協(xié)同作用。由于免疫器官的發(fā)育及淋巴細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中需要大量的氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等提供能量，且GABA代謝能產(chǎn)生豐富的谷氨酸，糖類(lèi)代謝過(guò)程能產(chǎn)生大量非必需氨基酸等非糖物質(zhì)，推測(cè)GABA及GMP提高雛雞免疫機(jī)能可能是通過(guò)增加大量的能源物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，抑或是通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)多種酶的活性來(lái)影響蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝［28-29］，從而促進(jìn)免疫器官的發(fā)育及淋巴細(xì)胞的增殖。但需要大量試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 GMP對(duì)雛雞免疫細(xì)胞發(fā)育的影響

白細(xì)胞總數(shù)的變化可以反映機(jī)體抵抗力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著發(fā)育的進(jìn)行，雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)增加，說(shuō)明機(jī)體的抵抗力增強(qiáng)。GABA組雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)高于CK組，說(shuō)明GABA能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。另一方面，研究表明，人參多糖［30］、黃芪多糖［31］等均有增加動(dòng)物外周血白細(xì)胞總數(shù)的作用，本試驗(yàn)研究表明，GMP組雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)高于GABA組與CK組，說(shuō)明GMP對(duì)雛雞免疫機(jī)能的增強(qiáng)作用優(yōu)于GABA，提示巴戟天多糖能夠增加雛雞外周血白細(xì)胞總數(shù)，且GABA與巴戟天多糖之間存在協(xié)同增強(qiáng)作用。有研究報(bào)道，GABA與黃芪多糖的復(fù)合物能夠增強(qiáng)肉雛雞血清新城疫抗體效價(jià)，且效果優(yōu)于黃芪多糖組與GABA組［21］。說(shuō)明GABA與黃芪多糖存在著協(xié)同增強(qiáng)作用。但目前對(duì)GABA與多糖復(fù)合物的研究較少，加之GABA本身作用機(jī)理的復(fù)雜性，對(duì)于該協(xié)同增強(qiáng)作用的深入作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.4 GMP對(duì)雛雞免疫因子發(fā)育的影響

溶菌酶是單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物。溶菌酶作為一種存在于動(dòng)物正常體液及組織中的非特異性免疫物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用［32］。高水平的溶菌酶含量說(shuō)明吞噬細(xì)胞處于較高的活化狀態(tài)，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗菌防御機(jī)能。補(bǔ)體是抗體分子的增強(qiáng)或輔助因子，在機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)、防御及免疫病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用［33］。C3存在于體液中，在補(bǔ)體激活過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，通過(guò)C3含量的測(cè)定可以反應(yīng)血清總補(bǔ)體水平，是衡量體液免疫的重要指標(biāo)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，GABA組及GMP組雛雞血清中的溶菌酶含量均高于CK組，說(shuō)明GABA與GMP均能增強(qiáng)機(jī)體巨噬細(xì)胞的活性，提高雛雞血清中溶菌酶的含量。同時(shí)，巨噬細(xì)胞活性的增加，又使其產(chǎn)生大量活性物質(zhì)，如溶細(xì)胞蛋白酶、溶酶體水解酶等，進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能。研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶含量的升高是由于高溫或者代謝旺盛條件下嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的破裂［34］，推斷本試驗(yàn)中的GABA及GMP組血清中溶菌酶含量增加的機(jī)制可能是在食用GABA和GMP后代謝旺盛條件下嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的破裂所引起的。

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加50 mg／kg GABA能顯著提高夏季高溫期蛋雞血清IgG、Ig A和C3的含量［35］；金線蓮多糖能夠提高小鼠血清C3蛋白含量，從而提高機(jī)體的免疫機(jī)能［36］。本研究表明，GABA及GMP均能夠提高雛雞血清中C3蛋白含量，且GMP組的作用優(yōu)于GABA。但對(duì)于GABA與多糖在提高血清C3蛋白含量的機(jī)制，需進(jìn)一步探索。研究證實(shí)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)關(guān)系［37］，在免疫細(xì)胞上可能存在某些激素和神經(jīng)遞質(zhì)的受體，它們可以調(diào)節(jié)免疫功能。GABA作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，是否也是通過(guò)該途徑來(lái)影響雛雞的免疫功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，GABA與巴戟天多糖復(fù)合物能夠顯著提高雛雞的生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能，且兩者之間存在著協(xié)同增強(qiáng)作用，但因GABA作為神經(jīng)傳遞介質(zhì)在動(dòng)物內(nèi)也是普遍存在，而外源性添加若劑量控制不好，會(huì)對(duì)其作用效果產(chǎn)生很大的影響，當(dāng)劑量超過(guò)機(jī)體耐受力的時(shí)候，有可能會(huì)引起休克或者死亡，當(dāng)劑量不足時(shí)效果卻不明顯。因此，如何在畜禽生產(chǎn)中使GABA能夠穩(wěn)定高效地發(fā)揮作用是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。另一方面，對(duì)于GABA與巴戟天多糖的具體的配比有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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