錢(qián)林東，唐 賀，李卓然，張自芳，袁 峰，錢(qián) 坤，苗永旺＊

（1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)系，云南 昆明650212；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，云南 昆明650201 3.湖州師范學(xué)院，浙江 湖州313000）

垂體轉(zhuǎn)錄因子（Pituitary-specific transcription factor，POU1F1）是POU結(jié)構(gòu)域中同源異型蛋白之一［1］。在哺乳動(dòng)物中，POU1F1夠促進(jìn)生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）細(xì)胞系、催乳素（prolactin，PRL）細(xì)胞系和促甲狀腺素β亞單位（thyroid stimulating hormoneβ，TSHβ）細(xì)胞系的生長(zhǎng)和發(fā)育，并對(duì)GH、PRL和TSHβ基因的表達(dá)起到正向調(diào)控的作用，其對(duì)哺乳動(dòng)物有提高生長(zhǎng)速度、降低脂肪沉積等廣泛的生物學(xué)功能。POU1F1基因只激活相關(guān)細(xì)胞中特異基因表達(dá)，同時(shí)抑制其他激素基因不適當(dāng)轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出強(qiáng)烈組織特異性，在哺乳動(dòng)物胚胎分化和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［1］。

牛的POU1F1基因位于1號(hào)染色體上，由調(diào)控區(qū)、6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，全長(zhǎng)19 654 bp，其mRNA全長(zhǎng)1 502 bp，編碼291個(gè)氨基酸［2］。其中POU特異性區(qū)域主要由第3和第4外顯子編碼；POU同源區(qū)由第5和第6外顯子編碼。研究發(fā)現(xiàn)，牛的POU1F1基因不僅在牛的胚胎發(fā)育中至關(guān)重要［3］，而且與奶牛的產(chǎn)奶量、乳成分等生產(chǎn)性狀以及肉牛的體重、腰肉厚度等生產(chǎn)性狀都存在相關(guān)性［4-5］?？梢?jiàn)，POU1FI基因與牛的養(yǎng)殖生產(chǎn)有著重要的關(guān)系。

云南本地黃牛多為沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)選育的原始品種。昭通黃牛主要分布于滇東北地區(qū)，屬于西南山地型黃牛；迪慶黃牛主要分布于滇西北高原，屬于高原型黃牛［6］。過(guò)去，對(duì)云南本地黃牛POU1F1基因的研究工作開(kāi)展的很少，本研究采用DNA序列分析和PCR-RFLP技術(shù)，以云南昭通黃牛和迪慶黃牛為研究對(duì)象，并以引進(jìn)品種短角牛、荷斯坦奶牛和安格斯牛為對(duì)照，對(duì)POU1F1基因的第5內(nèi)含子和第6外顯子進(jìn)行了基因克隆測(cè)序和群體變異檢測(cè)分析，以揭示POU1F1基因的特征，為今后云南黃牛的選育提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究樣品來(lái)自4個(gè)黃牛群體，其中包括3個(gè)云南本地群體和2個(gè)國(guó)外引進(jìn)品種。云南本地各群體樣品為：昭通黃牛（ZT）62頭、迪慶黃牛（DQ）22頭、云南荷斯坦奶牛（HOS）12頭；引進(jìn)品種樣品為：短角牛（SH）45頭、安格斯牛（ANG）10頭。采樣方式為隨機(jī)采樣，每頭牛頸靜脈采血10 m L，肝素鈉抗凝，然后與等體積的DNA保存液混合，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA的提取

參照《分子克隆》中的方法提取基因組總DNA［7］，經(jīng)紫外分光光度法重檢測(cè)其純度和濃度，稀釋成50 ng／μL濃度作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3 引物設(shè)計(jì)

引物由上海生工合成。根據(jù)文獻(xiàn)［8］，引物序列如 下：上 游 引 物：5＇-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3＇；下游引物：5＇-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3＇。

1.4 PCR-RFLP分析

1.4.1 PCR引物及反應(yīng)體系 PCR擴(kuò)增采用高保真DNA聚合酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）按照廠(chǎng)家說(shuō)明進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中含有基因組DNA約50 ng，引物20 pmol／L，d NTPs 10 mmol／L，MgCl21.5 mmol／L，r Taq酶0.5 U。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；然后35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，62℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸7 min。預(yù)期擴(kuò)增出POU1F1基因的第5內(nèi)含子和第6外顯子中包括突變位點(diǎn)的一段序列，長(zhǎng)度為451 bp。

1.4.2 酶切消化和基因分型 將PCR產(chǎn)物使用限制性?xún)?nèi)切酶HinfⅠ（Fermentas公司）在37℃水浴鍋中消化8 h，然后使用3.0%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后，使用TAKARA公司（大連寶生物）質(zhì)粒連接試劑盒將之連接到p MD18-T Vector載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化之后的大腸桿菌在加氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單克隆菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)PCR檢測(cè)后，選取呈陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒DNA，送上海生工測(cè)序。各種基因型分別選1個(gè)個(gè)體進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用PopGen32和Gen AlEx軟件計(jì)算POU1F1基因等位、頻率和遺傳距離等指標(biāo)，進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

對(duì)檢測(cè)的群體采用HinfⅠ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)為451 bp，經(jīng)HinfⅠ酶切后，可以得到A和B這2個(gè)等位基因，AA、BB和AB共3種基因型。A等位基因的PCR產(chǎn)物沒(méi)有HinfⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)消化后檢測(cè)沒(méi)有變化。B等位基因的PCR產(chǎn)物有1個(gè)HinfⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)消化后檢測(cè)得到長(zhǎng)度分別為244 bp和207 bp的2條帶。AA基因型僅可檢測(cè)到長(zhǎng)度為451 bp的1條帶；BB基因型可檢測(cè)到長(zhǎng)度為244 bp和207 bp的2條帶；AB基因型可檢測(cè)到長(zhǎng)度為451 bp、244 bp和207 bp的3條帶。

圖1 POU1F1基因的3種基因型1.AA型；2-5.BB型；6.AB型Fig.1 3 genetypes of the POU1F1 gene1.Genetype AA；2-5.Genetype BB；6.Genetype AB

2.2 POU1F1基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

研究的5個(gè)群體中，都發(fā)現(xiàn)了A和B兩種基因，各群體基因頻率和基因型頻率見(jiàn)表1。在荷斯坦牛中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AA型個(gè)體；在短角牛和安格斯牛中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BB型個(gè)體。昭通黃牛、迪慶黃牛和荷斯坦牛中，B等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因；短角牛和安格斯牛中，A等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)x2檢測(cè)，各群體都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表1 5個(gè)群體POU1F1-HinfⅠ基因座的基因頻率和基因型頻率Table 1 Gene and genotype frequencies at POU1F1-HinfⅠlocus in 5 populations

5個(gè)群體的POU1F1基因的遺傳多態(tài)性信息見(jiàn)表2。昭通黃牛和迪慶黃牛的雜合度高于短角牛和荷斯坦牛，但是低于安格斯牛。昭通黃牛、迪慶黃牛和安格斯牛的有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量都高于短角牛和荷斯坦牛。

2.3 群體間遺傳差異

5個(gè)群體間POU1F1基因的遺傳差異與相似系數(shù)見(jiàn)表3。由遺傳距離構(gòu)建的聚類(lèi)圖見(jiàn)圖2。

表2 5個(gè)群體POU1F1-HinfⅠ基因座遺傳多態(tài)性Table 2 Genetic diversity indices at POU1F1-HinfⅠlocus in 5 populations

表3 5個(gè)黃牛群體Nei＇s遺傳距離及相似系數(shù)Table 3 Genetic identity and genetic distance between the 5 cattle breeds

圖2 5個(gè)牛群體的Nei＇s（1978）遺傳距離聚類(lèi)圖Fig.2 Dendrogram of Nei＇s（1978）genetic distance among 5 cattle breeds

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

測(cè)序發(fā)現(xiàn)A等位基因和B等位基因的PCR產(chǎn)物存在2處差異。A等位基因產(chǎn)物在207 bp處為A，在281 bp處為T(mén)。與A等位基因相比，B等位基因的突變?yōu)锳207G和T281G。其中207處的突變?cè)斐闪薆等位基因產(chǎn)物上出現(xiàn)HinfⅠ酶切位點(diǎn)（GANTC）。

3 討 論

根據(jù)國(guó)外對(duì)意大利荷斯坦公牛［8］、利木贊牛［9］和波蘭黑白花奶牛［4］的POU1F1基因該段等位基因的研究結(jié)果，B等位基因在這3種牛中都是優(yōu)勢(shì)等位基因，其基因頻率分別為0.812、0.7269和0.75。國(guó)內(nèi)對(duì)秦川牛和中國(guó)荷斯坦牛的研究也發(fā)現(xiàn)，B等位基因在這2個(gè)群體中是優(yōu)勢(shì)等位基因，分別為0.768和0.868［10］。已經(jīng)研究的品種包括了奶牛和肉牛，而這2種用途的牛中，B等位基因都是優(yōu)勢(shì)等位基因，據(jù)此推測(cè)B等位基因可能對(duì)產(chǎn)奶和產(chǎn)肉性能都有正效應(yīng)。

在本研究所使用的荷斯坦牛中，B等位基因頻率達(dá)到了0.917，這與前人對(duì)荷斯坦牛的研究結(jié)果相符，說(shuō)明該荷斯坦牛群體受到了更強(qiáng)的人工選擇。而在本文的短角牛和安格斯牛中，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，其基因頻率分別為0.944和0.700，與前人對(duì)肉用牛的研究結(jié)果不完全一致，揭示短角牛和安格斯牛POU1F1基因具有不同的群體遺傳特征。云南本地黃牛多為沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)選育的原始品種。本研究中，昭通黃牛和迪慶黃牛的B等位基因頻率分別只有0.645和0.727。而雜合度和多態(tài)信息含量較高。這說(shuō)明這2個(gè)地方品種雖然受到了人工選擇，但是選擇強(qiáng)度并不大，提示它們?yōu)樵嫉胤脚７N，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強(qiáng)選育，淘汰生產(chǎn)性能不高的個(gè)體，繼續(xù)提高這2個(gè)群體的生產(chǎn)性能。至于本研究中安格斯牛的雜合度也較高，提示該?？赡艽嬖谝欢ǖ难y(tǒng)混雜，而短角牛、荷斯坦奶牛的雜合度相對(duì)較低，提示它們選育程度較高。

本研究結(jié)果可為利用POU1F1基因?yàn)楹蜻x基因進(jìn)行黃牛的肉用和奶用選育利用提供依據(jù)和遺傳背景資料。

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