胡雷光，朱立岳，謝 芳，陳 堅，王昕蕾

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院檢驗科，上海200040;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院腫瘤科，上海200040)

人類中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)最初被鑒定為一個相對分子質(zhì)量為25 000的蛋白，通過共價鍵連接于人中性白細(xì)胞明膠酶，且不易降解［1］。多年來，尿NGAL作為一個能反映急性腎損傷且可進(jìn)行危險度分層的生物標(biāo)志物越來越吸引國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界同仁的興趣［2-7］。順鉑(DDP)是廣泛應(yīng)用于治療多種腫瘤的有效的化療藥物，其作用有劑量依賴性，尤其是在腎臟中表現(xiàn)為高聚集、高排泄、高代謝，其腎毒性作用尤為突出［8］。動物研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型中通過順鉑誘導(dǎo)腎毒性損傷后，NGAL即可從腎小管細(xì)胞被快速誘導(dǎo)和分泌，不久可在尿中容易地被檢測到和定量［9］。因此，如何降低藥物性腎毒性，實現(xiàn)盡快診斷和干預(yù)，是目前臨床急需解決的課題。我們通過檢測DDP化療患者的尿NGAL等反映腎功能的微量蛋白指標(biāo)，探討尿NGAL在判斷腎小管損傷中的臨床價值。

材料和方法

一、研究對象

選擇2011年6月至2012年6月復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院腫瘤科住院的腫瘤患者58例，男25例，女33例，年齡55±7歲;罹患肺癌、乳腺癌、宮頸癌和腮腺癌等，均為經(jīng)手術(shù)或病理確診并接受順鉑(DDP)化療?；熐皺z查血肌酐值和尿常規(guī)均在生物參考區(qū)間內(nèi)，臨床上排除患有腎病史。58例患者中化療前共收集到57份尿液標(biāo)本，根據(jù)患者是否初次入院接受化療分為已化療組(32例)和未化療組(25例);化療后共收集54份尿液標(biāo)本，其中53份與化療前的標(biāo)本相配對，余下1份為化療后收集到的標(biāo)本。

隨機(jī)選取復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院體檢中心體檢正常者51名作為正常對照組，男22名，女29名，年齡54±8歲，經(jīng)病史詢問、體格檢查以及血糖、肝腎功能和尿常規(guī)等檢查排除有腎病等疾病史。

二、檢測方法

1.儀器與試劑 雅培i1000全自動化學(xué)發(fā)光儀，NGAL試劑盒和質(zhì)控品均為原裝配套。日立7170s全自動生化分析儀。N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑和質(zhì)控品由浙江康特公司提供;α1-微球蛋白(α1-MG)、尿白蛋白(mAlb)及尿肌酐(UCr)試劑由關(guān)東化學(xué)公司提供，質(zhì)控品由羅氏公司提供。

2.方法 正常對照者在體檢時、腫瘤患者在化療前24 h和化療后24 h分別留取約20 mL隨機(jī)尿，1 000×g離心10 min后留取上清液放置2管潔凈的加蓋樣品管內(nèi)，其中1管于當(dāng)日在日立7170s全自動生化分析儀上檢測 NAG、α1-MG、mAlb和Cr含量。另1管儲存于-70℃冰箱內(nèi)，集中檢測NGAL含量。2臺檢測儀器均使用相應(yīng)的質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS8.02統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb測定結(jié)果以 UCr進(jìn)行校正，即計算各項目與UCr的比值。各組比值數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗為非正態(tài)性分布，用中位數(shù)(M)［百分位(25% ～75%)］表示，使用均數(shù)間的多重比較的Levene’s檢驗，并進(jìn)行方差統(tǒng)計分析，配對資料使用Wilcoxon符號秩和檢驗，異常檢出率使用χ2檢驗。以NAG/UCr陽性作為腎小管損傷的判斷指標(biāo)，將全部觀察對象分為有損傷和無損傷2組，統(tǒng)計結(jié)果并繪制NGAL/UCr受試者工作特征(ROC)曲線。

結(jié) 果

一、化療前各組與正常對照組各項目檢測結(jié)果比較

除未化療組NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常對照組(P＜0.05)外，已化療組、未化療組和對照組之間其余項目差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

二、腫瘤患者DDP化療前、后的各項目檢測結(jié)果比較

化療前 NGAL/UCr、NAG/UCr、α1-MG/UCr與化療后比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而mAlb/UCr化療前、后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

三、化療前、后 NGAL/UCr、NAG/UCr和 α1-MG/UCr異常檢出率比較

化療前 NGAL/UCr異常率與 NAG/UCr、α1-MG/UCr及3項指標(biāo)聯(lián)合檢測的異常率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);化療后NGAL/UCr和3項指標(biāo)聯(lián)合檢測的異常率明顯高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P ＜0.05)。見表3。

表1 化療前各組與正常對照組之間各項目檢測結(jié)果比較

表2 腫瘤患者DDP化療前、后各項目檢測結(jié)果比較

表3 化療前、后3項指標(biāo)異常檢出率比較 ［例(%)］

四、NGAL/UCr的ROC曲線分析

將所有162例研究對象以NAG/UCr的陰、陽性結(jié)果與NGAL/UCr結(jié)果相對應(yīng)，繪制出ROC曲線。ROC曲線下面積(AUC)=0.770 1［95%可信區(qū)間:0.698 4～0.841 7］，按 α=0.05檢驗水準(zhǔn)，診斷試驗有判斷能力，診斷價值中等，診斷切割點在1.15 mg/mmol(靈敏度為82.09%、特異性為61.05%)。見圖1。

圖1 NGAL/UCr診斷腎小管損傷的ROC曲線

討 論

人類NGAL是一種小相對分子質(zhì)量分泌性蛋白，屬于lipocalin蛋白家族，近幾年愈來愈得到醫(yī)學(xué)界的興趣和關(guān)注。NGAL最初被鑒定為一個由178氨基酸殘段組成的單個多肽鏈，通過糖基化共價鍵與人中性白細(xì)胞明膠酶連接。分子克隆研究已提示人NGAL與誘導(dǎo)小鼠腎24p3基因產(chǎn)生的初級培養(yǎng)物相似，而X線晶體學(xué)實驗顯示在中性粒細(xì)胞和尿液中主要以單聚體、少許以二聚體或三聚體形式存在，隨后的實驗證明了NGAL是以一個復(fù)雜的共價鍵與相對分子質(zhì)量為92 000的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，明膠酶 B)相連接［1］。除此之外，NGAL主要與含鐵細(xì)胞表面膜受體(24p3R)以配位體形式連接并參與細(xì)胞內(nèi)鐵離子的轉(zhuǎn)運，在抗菌活力、炎性反應(yīng)、胚胎形成和腫瘤生長中發(fā)揮重要的作用［10］。

NGAL在正常的人類組織包括腎、氣管、肺、胃和腸中表達(dá)水平較低，但損傷的上皮組織可明顯表達(dá)。cDNA芯片技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)在腎缺血損傷后的近曲小管上皮細(xì)胞中NGAL的表達(dá)顯著增強。NGAL可在腎小管發(fā)生損傷時作為一個鐵轉(zhuǎn)移性蛋白，全部或部分定位于腎近曲小管，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的繁殖和修復(fù)促進(jìn)這些細(xì)胞存活，對腎臟起到保護(hù)作用［2］。雖然血漿中的NGAL可以自由通過腎小球，但絕大多數(shù)是在腎近曲小管通過有效mRNA依賴性的內(nèi)吞飲作用被重吸收。因此，尿液中出現(xiàn)NGAL僅可能是存在腎近曲小管損傷而妨礙其重吸收或體內(nèi)合成的大量增加［3］。另外關(guān)于基因?qū)W實驗報道，急性腎功能損傷時，在遠(yuǎn)端腎單位，尤其是在Henle’s彎的粗升攀枝和集合管中，產(chǎn)生一個快速和大量NGAL mRNA的正調(diào)節(jié)作用，其過度表達(dá)的目的是產(chǎn)生抗菌功能的作用，但結(jié)果使其合成增加而直接分泌入尿液中［5-6］。綜合各項研究結(jié)果，NGAL能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復(fù)過程，可作為檢測早期腎小管損傷的生物學(xué)指標(biāo)之一。

正常尿中有少量白蛋白存在，排泄量在0.03～0.3 mg/min的亞臨床范圍即mAlb。而α1-MG是一種相對分子質(zhì)量僅為26 000的糖蛋白，由167個氨基酸組成。血漿中游離α1-MG可自由通過腎小球，但99%被近曲小管重吸收，主要用于評估腎臟早期損傷時腎小管功能。而NAG是一種高分子糖蛋白，相對分子質(zhì)量較大，為140 000，也是體內(nèi)一種重要的溶菌體水解酶，在近曲小管上皮細(xì)胞中含量尤高。因不能通過腎小球基底膜，被認(rèn)為屬于腎小管標(biāo)志物。尿液中NAG明顯增多的原因是腎小管受損時，上皮細(xì)胞脫落、破壞，NAG釋放而產(chǎn)生［11-12］。因而尿NAG對于腎小管病變是一個已被公認(rèn)的靈敏度和特異性較強的指標(biāo)之一，可作為腎小管受損的早期診斷指標(biāo)。

順鉑(DDP)是一種無機(jī)重金屬，廣泛應(yīng)用于治療多種腫瘤的有效的化療藥物，其作用有劑量依賴性，但有腎毒性的風(fēng)險，頻繁干擾著高劑量的使用所產(chǎn)生的抗腫瘤療效。而DDP的病理作用機(jī)理之一是引起近端腎小管上皮細(xì)胞缺血、缺氧，甚至壞死，其早期往往首先損害腎近曲小管，尤其是近曲小管直段細(xì)胞，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂［13-14］。對于順鉑治療而導(dǎo)致腎損傷如何采取早期發(fā)現(xiàn)和防治一直是眾多學(xué)者研究的熱點［9，13-15］。

本研究檢測了腫瘤術(shù)后化療患者和正常對照者尿NGAL、NAG、α1-MG 和 mAlb。結(jié)果顯示，未化療組NGAL/UCr和NAG/UCr高于正常對照組(P＜0.05)。提示術(shù)后未化療的腫瘤患者相對于正常對照者已出現(xiàn)了輕度腎功能損傷，可能與手術(shù)或藥物對腎功能產(chǎn)生一定的影響有關(guān)，相對于α1-MG和 mAlb，NGAL、NAG或更顯敏感。已化療組與未化療組各項結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。產(chǎn)生的原因可能為順鉑化療效果雖然與其劑量成正相關(guān)，但是順鉑的早期輕度腎損害存在一定的可逆性，臨床上可以通過化療后使用消化道排毒和抗氧化劑的預(yù)防方法，降低藥物對腎臟的損傷從而起到保護(hù)作用［14］。但從化療前、后的對比分析來看，經(jīng)DDP一個療程化療后，尿中 NGAL、NAG和 α1-MG均明顯增高(P＜0.05)，而mAlb差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這顯示腫瘤患者化療后盡管血Cr未出現(xiàn)異常，但已出現(xiàn)了輕度腎功能損傷，而DDP藥物毒性作用主要是對近端腎小管造成損傷而不是腎小球，與文獻(xiàn)［9，14-15］報道基本一致。分析各項指標(biāo)的異常檢出率可以發(fā)現(xiàn)化療后NGAL/UCr和3項指標(biāo)聯(lián)合檢測的異常率明顯高于NAG/UCr、α1-MG/UCr(P＜0.05)。說明NGAL的靈敏度高于其他2項指標(biāo)，而三者聯(lián)合檢測更顯靈敏。從NGAL的ROC曲線分析，相對于公認(rèn)的NAG判斷指標(biāo)，對腎小管受損有早期診斷價值的最佳陽性判斷值為NGAL/UCr≥1.15 mg/mmol，此點的靈敏度為82.09%，特異性為61.05%。本研究認(rèn)為要尋找臨床對早期腎小管受損的最佳診斷值，應(yīng)將疑似患者做長期的追蹤研究直至尿常規(guī)、尿素和血Cr等腎功能指標(biāo)出現(xiàn)陽性結(jié)果，其間能結(jié)合臨床癥狀和腎穿刺或手術(shù)等病理檢查的金標(biāo)準(zhǔn)將更加完善。此法有待于進(jìn)一步地探討和研究。

Haase等［7］通過多中心的研究報道，雖然血清肌酐尚未出現(xiàn)臨床診斷性的改變，但尿中NGAL的增加可以判定患者的亞臨床診斷和不良的治療預(yù)后。隨著不斷深入的臨床診斷和治療的研究，對于腎功能輕微損傷的診斷手段也愈來愈多。尿NGAL/UCr對DDP化療患者的腎小管損傷和功能減退的檢出有一定的臨床價值。對于藥物性等腎毒性損傷，尿NGAL可以作為一種較為理想的生物標(biāo)志物。

［1］須 靜，胡曉波.中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白的研究進(jìn)展［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27(10):871-876.

［2］Mishra J，Ma Q，Prada A，et al.Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14(10):2534-2543.

［3］Schmidt-Ott KM，Mori K，Li JY，et al.Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(2):407-413.

［4］蔡雷鳴，厲 倩，金才峰，等.血清中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白檢測在急性腎功能損傷早期診斷中的臨床意義［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27(4):287-290.

［5］Ma Q，Devarajan P.Induction of proapoptotic Daxx following ischemic acute kidney injury［J］.Kidney Int，2008，74(3):310-318.

［6］Srichai MB，Hao C，Davis L，et al.Apoptosis of the thick ascending limb results in acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(8):1538-1546.

［7］Haase M，Devarajan P，Haase-Fielitz A，et al.The outcome of neutrophil gelatinase-associated lipocalinpositive subclinical acute kidney injury:a multicenter pooled analysis of prospective studies［J］.J Am Coll Cardiol，2011，57(17):1752-1761.

［8］Ramesh G，Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-alpha［J］.Kidney Int，2004，65(2):490-499.

［9］Mishra J，Mori K，Ma Q，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin:a novel early urinary biomarker for cisplatin nephrotoxicity［J］.Am J Nephrol，2004，23(3):307-315.

［10］Devireddy LR，Gazin C，Zhu X，et al.A cell-surface receptorforlipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake［J］.Cell，2005，123(7):1293-1305.

［11］ 托馬斯.臨床實驗診斷學(xué)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔纾?004:357-375.

［12］梁永正，史 偉，劉雙信，等.腎小管功能檢測在IgA腎病中的意義［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2004，25(2):185-186.

［13］Gonzales-Vitale JC，Hayes DM，Cvitkovic E，et al.The renal pathology in clinical trials of cis-platinum(Ⅱ)diamminedichloride［J］.Cancer，1997，39(4):1362-1371.

［14］曾 健，勞 山.順鉑腎毒性機(jī)制及其防護(hù)的研究進(jìn)展［J］. 中國實用醫(yī)藥，2008，3(10):194-195.

［15］Gaspari F，Cravedi P，Mandalà M，et al.Predicting cisplatin-induced acutekidney injury by urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin excretion:a pilot prospective case-control study［J］.Nephron Clin Pract，2010，115(2):c154-c160.