潘升華，安慧敏，吳文珍，孫利敏，張亮，陳國榮，夏康，池曉萍

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325200；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000）

宮頸低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）及高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的預(yù)后[1]及治療方法均不同，對陰道鏡活檢診斷LSIL的患者只要求在半年后隨訪宮頸細(xì)胞學(xué)；而對HSIL的患者則需要采用宮頸電環(huán)切術(shù)（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）或冷刀錐切等積極的治療措施[2]。我們在日常工作中經(jīng)常收到一些活檢僅診斷為LSIL，但因患者焦慮等社會性因素而非常規(guī)地施行了LEEP甚至子宮全切術(shù)的標(biāo)本，術(shù)后病理卻發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在HSIL。造成手術(shù)前后病理診斷不一致的原因可能包括活檢取材于HSIL的周邊組織、尚處于HSIL的初起狀態(tài)等，因而對活檢診斷為LSIL的病例有必要進(jìn)行進(jìn)一步甄別，以便對那些可能已經(jīng)實(shí)際存在HSIL或者將快速發(fā)展為HSIL的患者盡早進(jìn)行干預(yù)治療，從而更加有效地預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。

p16和ProEx C是近年研究、應(yīng)用較多的鑒別宮頸LSIL和HSIL的兩個(gè)抗體，我們通過免疫組織化學(xué)方法檢測p16和ProEx C在宮頸活檢病理診斷LSIL的標(biāo)本中的表達(dá)情況，以探討實(shí)現(xiàn)這種甄別的可能。

1 材料和方法

1.1 病理標(biāo)本 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院2007年1月至2013年6月間經(jīng)陰道鏡宮頸活檢病理診斷LSIL、短時(shí)間（11～89 d）之內(nèi)行LEEP或子宮全切術(shù)治療的病例141例，其中包括術(shù)后病理診斷為HSIL的病例83例（HSIL組）和隨機(jī)選取的術(shù)后病理診斷為LSIL的58例（LSIL組），均以其宮頸活檢標(biāo)本為研究對象。所有標(biāo)本均經(jīng)3位高年資主治醫(yī)師以上病理醫(yī)師在遮蔽原病理診斷的情況下分別重新閱片、確認(rèn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。免疫組織化學(xué)采用EnVison法。p16購自上海長島生物技術(shù)有限公司，為鼠抗人單克隆抗體（克隆號16P07），稀釋比為1:100；ProEx C的兩個(gè)組分TopoIIa（DNA topoisomerase IIa）及MCM 2（Minichromosome maintenance pro-tein 2）亦均購自上海長島生物技術(shù)有限公司，均為鼠抗人單克隆抗體（克隆號分別為Ki-S1和CRCT2.1），稀釋比分別是1:50和1:100，預(yù)先稀釋后混合制備為ProEx C。均常規(guī)設(shè)置陰性和陽性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 p16陽性表達(dá)見于胞核，可伴有胞漿染色，為部分或全層上皮著色。ProEx C定位于基底/基底旁細(xì)胞和病變細(xì)胞的胞核，部分可見胞漿著色。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考Shi等[3]和Ozaki等[4]的研究并作適當(dāng)調(diào)整，以便與組織學(xué)分級方法相一致，即ProEx C和p16的陽性結(jié)果取決于陽性細(xì)胞在鱗狀上皮垂直平面的分布情況：陽性細(xì)胞分布于鱗狀上皮下1/3為1+，鱗狀上皮下2/3為2+，超過下2/3到全層著色為3+，未見陽性細(xì)胞或僅見于基底及基底旁則標(biāo)為-。若各部位染色不均，則以最顯著處為準(zhǔn)。并將-及1+記為陰性表達(dá)，2+及3+記為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)處理使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16及ProEx C表達(dá)情況 p16在LSIL組染色較淺，呈淺棕色胞核或胞核伴胞質(zhì)染色，陽性部位多在鱗狀上皮下1/3處（見圖1）；其在HSIL組則染色深，呈棕色或深棕色，多呈鱗狀上皮全層染色（見圖2）。p16在LSIL組和HSIL組中陽性率分別為25.9%（15/58）及78.3%（65/83），LSIL組明顯低于HSIL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在LSIL組ProEx C染色淺，呈淺棕色、棕色胞核染色，陽性部位多位于基底部或旁基底部（見圖3）；HSIL組ProEx C染色深，呈棕色或深棕色，接近鱗狀上皮全層染色（見圖4）。ProEx C在LSIL組和HSIL中陽性率分別為36.2%（21/58）及63.9%（53/83），LSIL組低于HSIL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

圖1 p16在LSIL組中呈鱗狀上皮下1/3染色（×200）

圖2 p16在HSIL組中呈鱗狀上皮全層染色（×200）

圖3 ProEx C在LSIL組中呈基底部及旁基底部染色（×200）

圖4 ProEx C在HSIL組中呈鱗狀上皮幾乎全層染色（×200）

2.2 p16及ProEx C對存在HSIL的預(yù)測價(jià)值 p16、ProEx C、p16 & ProEx C和p16/ProEx C預(yù)測宮頸可能實(shí)際存在/將快速發(fā)展為HSIL的靈敏度分別為78.3%、63.9%、53.0%、89.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；p16或ProEx C其中之一呈陽性（p16/ProEx C）時(shí)有著最高靈敏度（89.2%），但與單用p16（78.3%）相比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。p16、ProEx C、p16 & ProEx C和p16/ProEx C預(yù)測HSIL的特異度分別為74.1%、63.8%、87.9%、50.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；當(dāng)p16和ProEx C同時(shí)陽性（p16 & ProEx C）時(shí)有著最高的特異度（87.9%），與單用p16（74.1%）相比較，其差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 p16及ProEx C在宮頸活檢病理診斷為LSIL標(biāo)本中的表達(dá)情況

3 討論

研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌及宮頸癌前病變發(fā)生的主要原因[5-6]。HPV感染宮頸鱗狀上皮后大部分患者能自行清除，僅少數(shù)人呈持續(xù)感染狀態(tài)，數(shù)年后逐步發(fā)展為CIN（cervical intraepithelial neoplasia）I、CINII、CINIII乃至浸潤性癌。目前認(rèn)為高危型HPV引起宮頸癌前病變和宮頸癌的機(jī)制與其產(chǎn)生的早期蛋白E6、E7有關(guān)。E6可以通過泛素鏈接酶E6AP與P53結(jié)合，引起P53的降解[7]；E7則可結(jié)合并阻斷視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）的活性[8]。通過E6-P53和E7-pRb途徑，HPV可以繞過正常細(xì)胞周期調(diào)控，啟動(dòng)細(xì)胞提前進(jìn)入增殖周期，引起腫瘤的發(fā)生，同時(shí)也造成包括p16、MCM2和TopoIIa在內(nèi)一系列的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的異常表達(dá)。

p16是由p16INK4a抑癌基因所編碼的核蛋白，主要通過與cyclin D1蛋白競爭性結(jié)合激酶CDK4/CDK6，抑制pRb磷酸化和E2F（adenovirus E2 promoter transcription factor）的釋放，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，而發(fā)揮抑制腫瘤生長作用。p16INK4a基因在多種腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、霍奇金病等中因發(fā)生缺失、突變、甲基化、RNA剪接加工錯(cuò)誤而失活，故呈低表達(dá)或失表達(dá)[9]；但在幾乎所有的HSIL、宮頸浸潤性鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和近70%的LSIL中均存在p16的過表達(dá)[3]。其分子機(jī)制為HPV的E7蛋白包繞宿主細(xì)胞Rb基因的產(chǎn)物pRb，并使之失活而釋放E2F，從而阻斷了p16抑制pRb磷酸化的活性，使得p16的抑癌功能喪失；同時(shí)破壞了p16-CDK4/CDK6-pRb-E2F負(fù)反饋環(huán)路，引起p16反應(yīng)性的過度表達(dá)[10]。因而p16過表達(dá)提示HPV DNA已經(jīng)整合入宿主細(xì)胞基因組，并導(dǎo)致了細(xì)胞的異常增殖，開始具有惡性演進(jìn)的傾向性。研究顯示隨著宮頸病變級別的升高，p16的表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng)[3]，且p16表達(dá)強(qiáng)度與高危型HPV的拷貝量呈正相關(guān)[11]。本組研究發(fā)現(xiàn)即使活檢病理診斷僅為LSIL，如果出現(xiàn)p16高表達(dá)，其宮頸仍存在HSIL或者將快速發(fā)展為HSIL的較大可能，p16可以作為預(yù)測宮頸活檢LSIL病變轉(zhuǎn)歸的標(biāo)記物。

ProEx C是由MCM 2和TopoIIa組成的雞尾酒抗體，用于檢測這兩個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)情況。MCM 2是MCM復(fù)合體的一個(gè)組分，后者是細(xì)胞DNA復(fù)制啟動(dòng)和延長的必需調(diào)控蛋白，在G1期負(fù)責(zé)前復(fù)制復(fù)合體的信息傳導(dǎo)，在S期則保持各基因組的穩(wěn)定。MCM 2在休眠細(xì)胞中低表達(dá)，在增生活躍的細(xì)胞中高表達(dá)，其在細(xì)胞從G0進(jìn)入G1期之前表達(dá)即開始升高，G1末期和S早期達(dá)到峰值[12]。研究表明，在高危型HPV感染和宮頸CIN病變時(shí)MCM 2過表達(dá)[13]。TopoIIa是TopoII的兩個(gè)同工酶之一，主要位于核基質(zhì)內(nèi)，通過調(diào)節(jié)DNA空間構(gòu)型變化，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、修復(fù)以及染色體分離等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。TopoIIa的表達(dá)有賴于細(xì)胞周期，在正常細(xì)胞中僅見于S期和G2/M期，但在腫瘤細(xì)胞中，TopoIIa表達(dá)率增高且不再依賴細(xì)胞增殖周期，其在G0、G1期即可出現(xiàn)表達(dá)[14]，使得在惡性增殖細(xì)胞中的表達(dá)比良性增生細(xì)胞更高。屈王蕾等[15]認(rèn)為隨著宮頸癌前病變程度的升高，TopoIIa蛋白表達(dá)隨之上調(diào)，且與細(xì)胞中高危型HPV的拷貝量呈正相關(guān)。ProEx C將MCM 2和TopoIIa聯(lián)合使用，可發(fā)揮兩個(gè)抗體的協(xié)同作用，防止單獨(dú)應(yīng)用MCM 2和TopoIIa時(shí)可能存在的漏標(biāo)情況[3，16]。Badr等[17]研究顯示在HSIL病變中ProEx C呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其表達(dá)率明顯高于LSIL，故認(rèn)為ProEx C可應(yīng)用于證實(shí)HSIL病變，并且猜想ProEx C可能可以用于分類LSIL。該猜想得到本組研究的支持，即在活檢診斷LSIL而術(shù)后檢出HSIL的標(biāo)本中ProEx C的陽性率為63.9%（53/83），高于術(shù)后仍為LSIL的陽性率36.2%（21/58），ProEx C可對病理診斷LSIL的活檢標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步篩選，ProEx C陽性表達(dá)，提示該LSIL患者預(yù)后欠佳。

p16和ProEx C在不同病變性質(zhì)的宮頸組織中的表達(dá)已有較多研究[3，17-19]，研究者較一致地認(rèn)為p16和ProEx C在宮頸HSIL及宮頸癌中呈高表達(dá)，在LSIL病變及反應(yīng)性病變中表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度較低，二者可以作為HSIL與LSIL鑒別的有效標(biāo)記物。然而，對于出現(xiàn)相對較強(qiáng)p16和ProEx C表達(dá)的LSIL，其預(yù)后、轉(zhuǎn)歸及生物學(xué)行為較之陰性表達(dá)的LSIL是否有所不同，相應(yīng)的是否應(yīng)該對這兩類LSIL采取不同的處理措施，卻少有報(bào)道。

本組研究以病理診斷LSIL的宮頸活檢標(biāo)本為對象，研究顯示宮頸活檢LSIL患者出現(xiàn)p16和/或ProEx C陽性表達(dá)，提示患者宮頸可能已經(jīng)存在HSIL或者將在短時(shí)間內(nèi)發(fā)展為HSIL，p16和ProEx C同時(shí)陽性時(shí)其靈敏度為53.0%（44/83），特異度達(dá)到87.9%（51/58），當(dāng)P16和ProEx C其中之一出現(xiàn)陽性表達(dá)時(shí)，敏感度為89.2%（74/83），特異度為50.0%（29/58）。可以認(rèn)為如果p16和ProEx C同時(shí)陽性，提示存在/將快速發(fā)展為宮頸HSIL的高度可能，應(yīng)當(dāng)盡早對患者采取LEEP等積極的干預(yù)治療，如果p16或ProEx C陽性，則可根據(jù)細(xì)胞學(xué)檢查、HPV感染、患者意愿等情況，積極隨訪或采取積極的治療。

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