金洲祥，王向昱

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325027）

合理的聯(lián)合用藥是腫瘤化療的基本原則，其目的是為了獲取藥物間的協(xié)同效應(yīng)。將各種化療藥物進行有機結(jié)合和多靶點治療以提高療效、降低毒性和克服耐藥成為當前腫瘤治療領(lǐng)域的一個新的研究熱點。目前對于晚期肝癌的藥物干預(yù)治療方案還是以5-氟尿嘧啶（5-FU）為主的綜合化療方案。5-FU本身不良反應(yīng)較大，長時間使用也存在耐藥性的問題，極大地限制了其在臨床上的大劑量應(yīng)用。因此尋求一種更有效的抗癌藥物或更有效的聯(lián)合用藥方案是提高肝癌臨床總體療效的關(guān)鍵。

有文獻報道三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）在體外對肝癌細胞株有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，其機制是使肝癌細胞阻滯于S期，從而抑制細胞增殖[1-2]，而5-FU是細胞周期特異性藥物，其抗肝癌作用主要是作用于S期細胞，因此，聯(lián)合用藥可能具有協(xié)同效應(yīng)。但是目前關(guān)于As2O3聯(lián)合5-FU應(yīng)用在肝癌治療中的相互作用關(guān)系鮮見報道，因此我們設(shè)計本實驗以研究體外As2O3聯(lián)合5-FU對小鼠肝癌細胞株H22增殖、凋亡的影響，為臨床上兩者聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠肝癌H22細胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；0.1% As2O3溶液（亞砷酸）購于哈爾濱伊達藥業(yè)公司；5-FU注射液為天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品；TUNEL試劑盒、RPMI 1640液體培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒和二甲基亞砜（DMSO）均為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.25%胰酶消化液、EDTA消化液、3% H2O2、PBS均為杭州昊天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 MTT法檢測藥物對小鼠肝癌H22細胞生長的抑制作用

1.2.1 細胞培養(yǎng)：小鼠肝癌H22細胞株接種于培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37 ℃及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，24 h更換培養(yǎng)液1次，取傳代后處于對數(shù)生長期細胞用于實驗。細胞傳代方法按照文獻[3]介紹的方法。1.2.2 MTT法檢測藥物對小鼠肝癌H22細胞增殖率的影響：取對數(shù)生長期的H22細胞制成每毫升含5×104個細胞的懸濁液，加入96孔培養(yǎng)板（每孔細胞數(shù)為1×104個）中培養(yǎng)24 h后，參考有關(guān)文獻[4-5]來確定各實驗組的藥物濃度，分為對照組（不加藥物）、As2O3（終濃度分別為0.5、1.0和2.0μg/mL）組、5-FU（20 mg/L）組、As2O3（終濃度分別為0.5、1.0和2.0μg/mL）+5-FU（20 mg/L）組，按兩因素析因設(shè)計分為8組，每組設(shè)3復(fù)孔。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48及72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）10μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加100μL的DMSO，振蕩10 min，使著色劑充分溶解后用Quant型酶標儀（Bio-Tek公司）在單波長570 nm下測出各孔吸光度（OD）值。按下列公式計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（1-處理組平均OD值/對照組OD值）×100%。以上實驗重復(fù)3次。并計算藥物相互作用系數(shù)（CDI）：CDI＝AB/（A×B）（其中AB為兩藥聯(lián)合組與對照組OD值的比值，A或B是各單藥組與對照組OD值的比值）。如CDI＜1，則兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；如CDI=1，則兩藥作用性質(zhì)為相加；如CDI＞1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗[6-7]。

1.3 TUNEL熒光染色法檢測藥物對小鼠肝癌H22細胞凋亡率的影響 取對數(shù)生長期H22細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)為1×106個。培養(yǎng)24 h后棄去上清液，分組方法同1.2.2。37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24、48、72 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集各組細胞。參照TUNEL試劑盒說明書操作，檢測細胞凋亡率。結(jié)果判斷標準：用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞的細胞核著綠色，并呈固縮狀或碎片狀。每片觀察5個高倍視野，細胞凋亡率用100個細胞中凋亡細胞個數(shù)百分比來表示。以上各濃度組均為3個復(fù)孔，最后結(jié)果為3個復(fù)孔的均值。上述實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 用SPSS 10.0軟件分析結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)均用±s表示，單處理因素各組間樣本均數(shù)的多重比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，兩組比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測藥物對H22細胞增殖的影響 結(jié)果顯示：在0.5～2.0μg/mL濃度范圍內(nèi)As2O3對小鼠肝癌H22細胞增殖呈明顯的抑制作用，且有時間-濃度依賴性，隨藥物濃度增加和作用時間的延長其抑制作用也增加；不同濃度的As2O3與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后對小鼠肝癌H22細胞增殖的抑制作用均較各相應(yīng)單藥組明顯增加（P＜0.01）。兩因素析因設(shè)計分析提示，As2O3聯(lián)合5-FU處理小鼠肝癌H22細胞24、48和72 h時兩藥交互作用有意義（P＜0.01）。具體見表1、圖1-2。

兩藥聯(lián)合作用時，計算兩藥CDI值來判斷合用效果。結(jié)果表明：As2O3與5-FU聯(lián)合作用H22細胞24和48 h時，兩藥具有協(xié)同作用（CDI＜1），作用72 h時，兩者之間為相加作用（CDI=1）。

表1 各組H22細胞的增殖抑制率（±s，%）

表1 各組H22細胞的增殖抑制率（±s，%）

作用時間（h） 5-FU（mg/L） As2O3（μg/mL）0 0.5 1.0 2.0 24 0 0 4.72±0.46 27.61±0.58 30.00±0.13 20 18.50±0.60 34.82±0.14 40.25±1.37 47.78±0.24 48 0 0 22.50±0.41 30.56±0.44 39.13±0.72 20 26.51±0.52 40.31±0.35 47.75±0.54 53.23±0.70 72 0 0 34.31±0.40 43.91±0.34 53.41±0.61 20 37.40±0.950 51.75±0.64 55.98±0.10 61.07±0.21

圖1 不同濃度As2O3對小鼠肝癌H22細胞株增殖的影響

圖2 不同濃度As2O3聯(lián)合5-FU對小鼠肝癌H22細胞株增殖的影響

2.2 TUNEL熒光染色法檢測藥物對H22細胞株凋亡的影響 單用As2O3或5-FU處理H22細胞，或經(jīng)不同濃度As2O3聯(lián)合5-FU作用24、48、72 h后，在熒光顯微鏡下均可觀察到H22細胞出現(xiàn)細胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)為凋亡細胞核染色質(zhì)著綠色并呈固縮狀或碎片狀。半定量計數(shù)結(jié)果表明，不同濃度As2O3聯(lián)合5-FU對H22細胞的凋亡誘導(dǎo)率均較各相應(yīng)的單藥組明顯增強，其誘導(dǎo)凋亡作用與藥物亦呈明顯的量效與時效關(guān)系。兩因素析因設(shè)計分析顯示，As2O3和5-FU處理H22細胞24、48和72 h，兩藥誘導(dǎo)細胞凋亡均有交互作用，P＜0.01（見表2、圖3-4）。

3 討論

目前研究認為，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅是腫瘤細胞增殖和分化異常所致，而且還是腫瘤細胞凋亡異常的結(jié)果[8]。因此，抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡，對臨床治療腫瘤有指導(dǎo)意義。臨床上化療是治療癌癥的一種重要的手段，通常為增強療效，都是聯(lián)合使用幾種藥物。合用具有不同作用的幾種藥物，可以殺死更多的癌細胞并可降低人體對某種特定藥物產(chǎn)生耐藥性的可能，同時以幾種方式攻擊癌細胞，比單用一種藥物更有療效。

5-FU屬細胞周期特異性藥物，主要作用于S期細胞，其作用機制是在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榉遴奏っ撗鹾塑账幔‵dUMP），在輔因子5，10-亞甲基四氫葉酸（CH2FH4）的參與下，代替正常的脫氧核苷酸（dUMP)，與胸苷酸合成酶（TS）形成三聯(lián)復(fù)合物，使TS失活，從而阻斷dUMP甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠TMP)過程，影響細胞DNA的合成（S期），最終導(dǎo)致細胞死亡[9]。As2O3俗稱砒霜，是一種傳統(tǒng)中藥，19世紀，西方國家曾有人用砷劑（如含As2O3的Fowlers液)口服治療白血病。20世紀70年代我國學(xué)者首先發(fā)現(xiàn)其治療急性早幼粒細胞白血病（APL）效果顯著，并取得了較好的臨床療效，其作用機制是誘導(dǎo)APL細胞凋亡而抑制腫瘤生長[10]。近年來有報道稱，As2O3在體外對人的肝癌細胞株有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)控細胞周期等作用[1-2，11-12]。有研究證實As2O3較某些化療藥物具有更強的誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的效應(yīng)[13]。砷劑引起細胞凋亡的可能機制是：砷可直接與蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合，影響巰基酶的活性，使蛋白質(zhì)滅活，引起細胞代謝異常，發(fā)生細胞凋亡[14]；還能下調(diào)抑凋亡基因bcl-2，增加促凋亡基因bax的表達以及改變兩者之間的比例，促使Fas基因的表達增強，促進其凋亡[15]。劉琳等[1]研究發(fā)現(xiàn)，As2O3選擇性誘導(dǎo)人肝癌細胞QGY-7701和QGY-7703凋亡，細胞周期延長，細胞集中在S期。

表2 各組H22細胞的凋亡率（±s，%）

表2 各組H22細胞的凋亡率（±s，%）

作用時間（h） 5-FU（mg/L） As2O3（μg/mL）0 0.5 1.0 2.0 24 0 1.95±0.17 14.20±0.38 25.38±0.37 31.11±0.40 20 35.04±0.79 44.92±0.60 53.25±0.60 61.22±0.42 48 0 2.01±0.12 20.25±0.33 40.10±0.38 59.36±0.32 20 60.00±0.44 66.93±0.51 74.72±0.53 85.34±0.44 72 0 2.31±0.19 22.07±0.10 42.16±0.64 62.66±0.28 20 64.42±1.05 69.66±0.40 78.02±0.13 87.67±0.93

圖3 各組H22細胞凋亡情況（TUNEL，×200）

圖4 不同濃度As2O3單獨或聯(lián)合20 mg/L 5-FU作用48 h后細胞凋亡率

目前關(guān)于聯(lián)合As2O3與其他抗腫瘤藥物體外殺傷肝癌細胞的協(xié)同作用的機制國內(nèi)外尚鮮見文獻報道。根據(jù)抗癌藥物的敏感標準，藥物的敏感性與其抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生率有關(guān)，抑制腫瘤細胞增殖的能力或誘導(dǎo)癌細胞凋亡的閾值與化療效果有著某種內(nèi)在聯(lián)系[16]。因此本實驗研究觀察了體外As2O3與5-FU單用和聯(lián)合處理小鼠肝癌H22細胞后，測定抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力，探討體外聯(lián)合用藥的特性，為進一步的體內(nèi)實驗提供可行性依據(jù)。

本實驗采用MTT法觀察As2O3聯(lián)合5-FU對小鼠肝癌H22細胞增殖的影響。結(jié)果證明，在0.5～2.0μg/mL濃度范圍內(nèi)As2O3對小鼠肝癌H22細胞呈明顯的抑制增殖作用，與近年來的相關(guān)報道[17]相一致。不同濃度的As2O3與5-FU聯(lián)合作用，對小鼠肝癌H22細胞的抑制增殖作用均較相同時間內(nèi)單用其中任何一種藥物時明顯增強，且隨著作用時間的延長和藥物濃度增加，作用效果也顯著增加。兩因素析因設(shè)計分析顯示，As2O3聯(lián)合5-FU處理小鼠肝癌H22細胞24、48和72 h，兩藥均有交互作用（P＜0.01）。根據(jù)藥物受體動力學(xué)規(guī)律，若兩藥在任何劑量條件下合用均超過其中強藥的最大反應(yīng)，則兩藥可能作用于不同受體。結(jié)合本實驗中As2O3與5-FU同時合用后對小鼠肝癌H22細胞的增殖抑制率明顯高于單獨使用，提示此兩藥在體外可能通過作用于不同的受體對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用。

CDI評價顯示，聯(lián)合用藥24和48 h時，作用性質(zhì)為協(xié)同；聯(lián)合用藥72 h時，作用性質(zhì)為相加。以上分析提示，在一定時間內(nèi)As2O3與5-FU合用后對小鼠肝癌H22細胞的增殖抑制作用明顯提高，兩者具有協(xié)同作用，藥物在不同時間相互作用的性質(zhì)不同，其機制有待進一步深入研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，體外As2O3在0.5～2.0μg/mL 濃度范圍內(nèi)對小鼠肝癌H22細胞呈明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。不同濃度的As2O3與5-FU聯(lián)合作用后，誘導(dǎo)小鼠肝癌H22細胞凋亡作用均較單用其中一藥物時增強，且隨著作用時間的延長和藥物濃度增加，作用效果也顯著增加。兩因素析因設(shè)計分析顯示，As2O3聯(lián)合5-FU處理H22細胞24、48和72 h，兩藥均有交互作用（P＜0.01）。這說明As2O3能誘導(dǎo)小鼠肝癌H22細胞凋亡。聯(lián)合5-FU后能顯著提高細胞凋亡率，為我們下一步對體內(nèi)移植瘤影響的研究提供了理論和實驗依據(jù)。

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