朱烈烈，戴慧芳，李永領(lǐng)，陳大慶

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325027）

應(yīng)激性胰島素抵抗（insulin resistance，IR）現(xiàn)象在各種類型創(chuàng)傷應(yīng)激中均普遍存在。目前機(jī)制尚未完全清楚。已有研究提示術(shù)后早期的IR與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter-4，GLUT4）的轉(zhuǎn)位功能障礙關(guān)系密切[1]。但GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體系的效能除了與GLUT4的轉(zhuǎn)位有關(guān)外，還與GLUT4的基因表達(dá)有關(guān)[2]。目前有關(guān)應(yīng)激所致IR與GLUT4基因表達(dá)的關(guān)系，所知甚少。另外，糖預(yù)處理作為一種十分簡(jiǎn)捷有效的策略，已經(jīng)在腹部外科及髖關(guān)節(jié)置換術(shù)等外科實(shí)踐中證實(shí)其在減輕術(shù)后應(yīng)激性IR程度方面的價(jià)值[3]，但具體作用位點(diǎn)存在爭(zhēng)議[4-5]。本研究采用改進(jìn)型Feeney自由落體創(chuàng)傷性腦損傷模型[6]，通過RT-PCR法測(cè)定大鼠外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）GLUT4 mRNA的表達(dá)來探討顱腦創(chuàng)傷后IR發(fā)生的機(jī)制以及糖預(yù)處理策略對(duì)其的影響。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 胰島素檢測(cè)試劑盒（放射免疫法，天津德普公司）、一步法總RNA提取劑（Trizol Reagent，Invitrogen，USA）、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Promega，USA）、Random-6-Primer（Takara，Japan）、GLUT4及β-actin上下游引物（3OD，北京奧科公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 健康成年雄性同窩別Wistar大鼠36只, 體質(zhì)量300～350 g，平均322 g。購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（鄂）2011-0005]。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)。 隨機(jī)分為對(duì)照組、創(chuàng)傷性腦損傷組和糖預(yù)處理組，每組各12只。各組均在實(shí)驗(yàn)前禁食水12 h，采用自制改進(jìn)型Feeney自由落體創(chuàng)傷性腦損傷裝置，用40 g砝碼從25 cm高處墜落致重型腦創(chuàng)傷，對(duì)照組不致傷。糖預(yù)處理組在致傷前3 h通過胃管灌入糖負(fù)荷10%葡萄糖溶液30 mL，其余處理同創(chuàng)傷性腦損傷組。

1.3 血糖和血清胰島素測(cè)定 分別在傷前1/2 h、傷后3 h、24 h、72 h和7 d測(cè)定各組血糖和血清胰島素。每次取鼠尾血1滴用OneTouch微型血糖儀測(cè)血糖，另取血1.0 mL用于血清胰島素測(cè)定。將結(jié)果進(jìn)行公式法[7]評(píng)定IR的程度：胰島素敏感性（IAI）指數(shù)（FPG：血糖濃度；FINS：胰島素濃度）計(jì)算各時(shí)點(diǎn)的IAI。

1.4 骨骼肌和皮下脂肪組織樣本制備 三組均于上述相應(yīng)采血時(shí)刻取大鼠股四頭肌部位骨骼肌和皮下脂肪樣本約0.1～0.2 g，立刻放入液氮中冷凍，30 min后置于-80 ℃凍存。待RT-PCR檢測(cè)樣本GLUT4 mRNA含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用±s表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖變化 與對(duì)照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組在傷后3 h血糖即已升高（P＜0.05），至傷后24 h達(dá)到峰值（P＜0.01），隨后逐漸下降，直到傷后7 d尚未恢復(fù)至傷前水平（P＜0.05）。糖預(yù)處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)血糖升高（P＜0.05），其余同創(chuàng)傷性腦損傷組。見表1。

表1 各組大鼠血糖變化（n=12，±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血糖變化（n=12，±s，mmol/L）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別對(duì)照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預(yù)處理組傷前1/2h 2.53±0.21a 2.45±0.39a 3.31±0.25a傷后3h 2.44±0.36a 4.31±0.40a 4.40±0.71a傷后24h 2.28±0.29b 6.55±0.76b 6.32±0.91b傷后72h 2.61±0.56a 4.52±0.68a 4.05±1.98a傷后7d 2.65±0.27a 3.72±0.86a 3.65±0.18a

2.2 血清胰島素變化 與對(duì)照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組在傷后3 h血清胰島素即已升高（P＜0.01），到傷后24 h達(dá)到峰值（P＜0.01），隨后逐漸下降，直到傷后72 h恢復(fù)到對(duì)照組水平。糖預(yù)處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)胰島素升高（P＜0.05），其余同創(chuàng)傷性腦損傷組。見表2。

表2 各組大鼠血清胰島素變化（n=12，±s，mU/L）

表2 各組大鼠血清胰島素變化（n=12，±s，mU/L）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別對(duì)照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預(yù)處理組傷前1/2h 12.43±2.30a 11.38±3.01a 18.01±4.05a傷后3h 14.03±2.91b 25.22±4.42b 22.49±6.19b傷后24h 14.48±3.38b 28.95±3.86b 26.01±0.91b傷后72h 14.81±2.09 15.90±2.64 14.24±3.99傷后7d 13.47±3.18 12.72±4.76 13.97±5.45

2.3 IAI變化 與血糖和胰島素變化趨勢(shì)一致，與對(duì)照組比，創(chuàng)傷性腦損傷組IAI在傷后3 h即已下降（P＜0.05），到傷后24 h達(dá)到谷值（P＜0.01），隨后逐漸回升，直到傷后7 d恢復(fù)至對(duì)照組水平。糖預(yù)處理組則在傷前1/2 h即出現(xiàn)IAI下降（P＜0.05），同樣在傷后24 h達(dá)到谷值，但與創(chuàng)傷性腦損傷組比較，傷后24 h糖預(yù)處理組IAI下降較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠胰島素敏感性變化（n=12±s）

表3 各組大鼠胰島素敏感性變化（n=12±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與創(chuàng)傷性腦損傷組比：cP＜0.05

組別對(duì)照組創(chuàng)傷性腦損傷組糖預(yù)處理組傷前1/2h-3.66±0.21-3.30±0.19-5.00±0.23傷后3h-3.82±0.29a-5.19±0.67a-5.32±1.01a傷后24h-3.50±0.46cc-6.16±0.96bc-5.83±0.26ac傷后72h-3.48±0.43a-4.21±0.55a-3.51±0.41a傷后7d-3.25±0.77-3.92±0.44-3.32±1.23

2.4 骨骼肌和脂肪組織中GLUT4 mRNA的表達(dá)量 同對(duì)照組類似，創(chuàng)傷性腦損傷組骨骼肌樣本GLUT4 mRNA表達(dá)量在各個(gè)采集點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但與對(duì)照組比，在脂肪組織樣本上，傷后24 h、72 h時(shí)刻均出現(xiàn)了脂肪細(xì)胞GLUT4 mRNA的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。糖預(yù)處理組情況類似，但與創(chuàng)傷性腦損傷組比，脂肪組織傷后24 h時(shí)刻GLUT4 mRNA表達(dá)下降較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組大鼠骨骼肌和皮下脂肪樣本GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（n=12±s）

表4 兩組大鼠骨骼肌和皮下脂肪樣本GLUT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（n=12±s）

注：GLUT4 mRNA表達(dá)量以GLUT4與β-actin的光密度比值反映；與對(duì)照組比：aP＜0.01；與創(chuàng)傷性腦損傷組比：bP＜0.05

組別對(duì)照組 骨骼肌皮下脂肪創(chuàng)傷性腦損傷組 骨骼肌皮下脂肪糖預(yù)處理組 骨骼肌皮下脂肪傷前1/2h 1.0273±0.2051 0.6266±0.2132 0.9663±0.2207 0.7389±0.1974 1.0692±0.2679 0.6904±0.1681傷后3h 0.9905±0.1939 0.6077±0.1834 0.9629±0.1709 0.6389±0.1268 0.9496±0.1857 0.6011±0.0997傷后24h 0.9546±0.0783aa 0.5704±0.0783ab 0.8632±0.0955ab 0.2377±0.0863ab 0.9008±0.0798ab 0.3603±0.0938ab傷后72h 0.8909±0.1225a 0.5747±0.1506a 0.9509±0.1160 0.2500±0.1743a 1.0072±0.1403a 0.2408±0.1431a傷后7d 0.9932±0.1508 0.6679±0.1551 0.9061±0.2096 0.5443±0.2800 0.1063±0.2001 0.6403±0.1897

3 討論

創(chuàng)傷后IR作為一種特殊的IAI下降現(xiàn)象，是指由于創(chuàng)傷應(yīng)激，產(chǎn)生一系列神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的變化，引起機(jī)體對(duì)IAI暫時(shí)性下降，從而引起相應(yīng)物質(zhì)代謝和生理機(jī)能的紊亂[8]。目前對(duì)應(yīng)激性IR產(chǎn)生的機(jī)制和作用位點(diǎn)缺乏深入全面的了解。

本研究結(jié)果顯示，IAI在創(chuàng)傷后3 h即出現(xiàn)下降，與對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在傷后24 h達(dá)到谷值，且能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間（7 d）。這提示重型顱腦創(chuàng)傷大鼠模型上存在胰島素敏感性的暫時(shí)性下降即胰島素抵抗的現(xiàn)象。這與人類擇期手術(shù)上的研究結(jié)果一致，差異在于胰島素抵抗的達(dá)峰和持續(xù)時(shí)間等方面，考慮與種屬及應(yīng)激強(qiáng)度的不同有關(guān)[8]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，作為臨床上曾用作控制術(shù)后應(yīng)激性高血糖反應(yīng)的措施之一的糖預(yù)處理，在本模型上能使出現(xiàn)胰島素抵抗的時(shí)間（傷前1/2 h）提前，同時(shí)使胰島素抵抗的程度下降。這驗(yàn)證了糖預(yù)處理具有減輕胰島素抵抗的作用。

本研究還進(jìn)一步探討了創(chuàng)傷后胰島素抵抗的機(jī)制及糖預(yù)處理效應(yīng)的作用位點(diǎn)。借鑒糖尿病相關(guān)研究[9-10]，本研究選取外周組織（骨骼肌和皮下脂肪）的GLUT4轉(zhuǎn)錄層面為切入點(diǎn)和研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)大鼠骨骼肌樣本的GLUT4 mRNA的表達(dá)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均無變化，而脂肪組織樣本則在傷后24 h和72 h采集點(diǎn)出現(xiàn)表達(dá)量的下降。結(jié)合胰島素敏感性的不同步變化（傷后3 h即出現(xiàn)下降），同時(shí)綜合考慮已知的外周胰島素刺激的葡萄糖攝取，80%以上由骨骼肌負(fù)責(zé)，脂肪組織的GLUT4介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)只占很小的份額[2]，可以得出：在應(yīng)對(duì)創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)骨骼肌和脂肪組織在GLUT4轉(zhuǎn)錄水平上存在生物學(xué)行為的差異，但不管是對(duì)于脂肪組織還是骨骼肌組織，均難以用其GLUT4 mRNA的表達(dá)變化來解釋總體上重型創(chuàng)傷性腦損傷后胰島素抵抗的發(fā)生。

有關(guān)服糖的作用位點(diǎn)目前研究較少且有爭(zhēng)議。有人認(rèn)為術(shù)前服糖主要影響術(shù)后葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化代謝，而對(duì)糖的非氧化利用影響不大。但動(dòng)物肌樣本的體外研究中并未發(fā)現(xiàn)糖預(yù)處理有影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)的效果，不過未排除服糖確實(shí)有促進(jìn)糖氧化的作用[4-5]。本研究驗(yàn)證了糖預(yù)處理減輕創(chuàng)傷后IR的效果，但這種效果并未在骨骼肌GLUT4 mRNA的表達(dá)量上獲得體現(xiàn)。盡管在脂肪組織相應(yīng)時(shí)刻GLUT4 mRNA的表達(dá)上與糖預(yù)處理效應(yīng)一致，但如上述，脂肪組織GLUT4介導(dǎo)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)只占20%不到的份額，該結(jié)果反映了服糖所致的減輕術(shù)后IR效應(yīng)總體上與外周組織GLUT4轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)聯(lián)性不高。因此，本研究基本可以認(rèn)為：至少在重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型上，糖預(yù)處理減輕IR的作用位點(diǎn)不在GLUT4 mRNA水平。

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