王敏，張海燕，，楊金良，劉鑫，嚴華，李建輝，張朝暉，崔鳳云，何悅，葉曉霞

（1.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 食品實驗室，北京 100026）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是目前廣泛應用在畜禽抗感染治療中的重要藥物之一，在家禽養(yǎng)殖業(yè)方面，SAs可預防球蟲病、霍亂和感染性鼻炎，但SAs有不良反應，可導致過敏反應和造血紊亂。國際食品法典委員會（CAC）和許多國家對食品和飼料中的SAs含量作了明確的規(guī)定[1-2]。

質譜是對未知化合物分子進行定性和解析的重要工具[3-6]。高能誘導裂解（higher energy collision induced dissociation，HCD）技術是一項新型的質譜裂解技術，與離子阱質譜常用的碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID）技術相比，HCD技術提供了穩(wěn)定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中產(chǎn)生的低質量碎片丟失（cutoff）效應，與Orbitrap質量分析器結合還可提供高分辨質譜數(shù)據(jù)[7-9]。HCD技術在蛋白質、肽段的鑒定和測序領域具有突出優(yōu)勢，在代謝物鑒定、食品添加物分析方面也有文獻[7-17]報道。

有關SAs在三重四級桿和離子阱質譜中的裂解方式已有文獻[18-26]報道，但其高能裂解機制尚鮮見報道。我們通過對SAs藥物結構母核鑒定技術進行研究，掌握LTQ-Orbitrap XL多級高分辨質譜對藥物特征基團的判定在獸藥中的應用，對常見的15種SAs在高能裂解池中的裂解規(guī)律進行了研究，得到更為豐富的離子信息，并對比了HCD和CID兩種裂解模式的差異。

1 材料和方法

1.1 儀器設備 LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-軌道離子阱高分辨組合式質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），配置電噴霧離子源（ESI源）。

1.2 試劑和材料 15種SAs標準品均購自Dr.Ehrenstorfer公司，分別是磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）、磺胺-6-甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺甲氧噠嗪（sufamethoxy pyridazine）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine）、磺胺氯噠嗪（silfachloropyridazine）、磺胺甲基異噁唑（sulfamethoxazole）、磺胺二甲噁唑（sulfamoxol）、磺胺苯吡唑（sulfaphenzole）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizol）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺醋酰（sulfacetamide）、磺胺噻唑（sulfathiazloe）、磺胺胍（sulfaguanidne monohydrate），純度均在98%以上。結構見圖1。其他試劑均為色譜純，標準品用50%甲醇水溶液配置成100 ng/mL的混合溶液。實驗用水為Milli-Q超純水。

圖1 15種SAs的分子結構式

1.3 質譜條件 ESI正離子模式下蠕動泵直接進樣，流速10μL/min。噴霧電壓4.5 kV，毛細管溫度350℃，殼氣流速30 arb，HCD裂解碰撞氣為高純氮氣，HCD歸一化碰撞能量55.0%。CID裂解碰撞氣為高純氦氣，CID歸一化碰撞能量55.0%。

2 結果和討論

2.1 磺胺類化合物的HCD裂解 15種SAs化合物在ESI正離子模式下的一級質譜均產(chǎn)生準分子離子峰[M+H]+，說明SAs化合物易與H+結合形成[M+H]+。通過相應的HCD二級質譜掃描，得到了各化合物的碎片離子峰信息。比較15種SAs的HCD二級質譜圖，發(fā)現(xiàn)均存在特征離子[C6H6NSO2]+m/z 156.01138、[C6H6NO]+m/z 108.04439、[C6H6N]+m/z 92.04948和[C5H5]+m/z 65.03858（如圖2所示）。相關文獻[24]曾報道SAs的準分子離子[M+H]+在質譜中進一步裂解，主要裂解在-SO2-兩端進行，實驗數(shù)據(jù)和我們的實驗結果相符（見圖3）。但是對于m/z 65，文獻報道該離子碎片是由S-N鍵和C-S鍵同時斷裂生成離子HS·+O2

[24]。本研究運用ESI源也產(chǎn)生質荷比為m/z 65.03831的子離子，與HS·+O2（m/z 64.96918）質量誤差為106 ppm，推斷該子離子的分子式可能不是HS·+O2。從精確分子質量考慮，我們提出另一種質譜裂解方式：碎片離子m/z 65.03858是由子離子[C6H6N]+m/z 108.04439進一步裂解產(chǎn)生的[C5H5]+（見圖2）。同時我們查找了具有苯胺結構的化合物的相關文獻，發(fā)現(xiàn)該類化合物裂解時產(chǎn)生[C5H5]+m/z 65這一裂解碎片[27]。

圖2 SAs的HCD裂解示意圖

圖3 15種SAs在HCD與CID模式下的質譜圖比較（碰撞能量：55% eV）

磺酰胺N上連接不同的基團（R基）形成了不同的磺胺類化合物，除上述特征裂解途徑外，失去R基也是磺胺類化合物的裂解途徑之一，通過這種裂解途徑可得到R基的信息。以磺胺-6-甲氧嘧啶（3）為例，m/z 281.07048是[M+H]+峰，在分辨率為30000時高分辨質譜測得的質量誤差為0.7×10-6，符合最新的歐盟（SANCO/10684/2009）化合物確證指令。除共有的特征碎片離子外，磺胺-6-甲氧嘧啶還產(chǎn)生了其他豐度較高的碎片離子，這些碎片離子反映了R基的取代信息：離子碎片m/z 126.06624是SN鍵斷裂后失去C6H5NO2S，正電荷保留在含N端產(chǎn)生的[C5H8N3O]+；碎片離子m/z 188.01265是C-S鍵斷裂后，正電荷保留在含S端生成的[C5H6N3O3S]+；而碎片離子m/z 215.09287則是失去HSO2產(chǎn)生的[C11H11N4O]+（如圖4所示）。

圖4 磺胺-6-甲氧嘧啶的高能裂解推導（碰撞能量：55% eV）

表1 15種SAs在HCD與CID模式下的質譜碎片峰比較（碰撞能量：55% eV）

2.2 磺胺類化合物HCD裂解與CID裂解方式的比較比較HCD和CID兩種裂解模式下的實驗結果，發(fā)現(xiàn)HCD的裂解碎片更為豐富，改善了cut-off效應（如圖3、表1所示）。以磺胺二甲嘧啶為例，當HCD和CID的碰撞能量均為55%時，CID裂解主要生成碎片離子m/z 186.03338、m/z 204.04393、m/z 124.08695和m/z 156.01135。推斷其裂解機制為，CS鍵斷裂生成[C6H8N3O2S]+m/z 186.03338，再經(jīng)分子離子反應，加合一分子H2O后形成離子[C6H8N3O2S·H2O]+m/z 204.04393；S-N鍵斷裂，生成[C6H6NSO2]+m/z 156.01135和[C6H10N3]+m/z 124.08695。HCD與CID相比，具有共同的碎片離子峰m/z 186.03320、m/z 204.04374、m/z 124.08684和 m/z 156.01135，都是在-SO2-基團兩端進行的裂解。除此之外，HCD還生成了[C12H13N4]+m/z 213.11342、[C6H6NO]+m/z 108.04431、[C6H6N]+m/z 92.04939和[C5H5]+m/z 65.03837等離子。在相同碰撞能量的CID模式下未得到這些離子碎片，需做三級質譜掃描才能得到與HCD較為相似的裂解碎片信息。

3 結論

SAs是一類傳統(tǒng)的合成抗菌藥物，因其具有對氨基苯磺酰胺結構，在ESI正離子模式中產(chǎn)生[M+H]+分子離子，在HCD裂解過程中以-SO2-NH-基團為中心，發(fā)生S-N鍵的斷裂，產(chǎn)生特征離子m/z 156.01138、m/z 108.04439、m/z 92.04948和m/z 65.03858。HCD二級質譜產(chǎn)生的特征碎片離子可作為磺胺類化合物的判斷依據(jù)，而通過R基團斷裂的碎片離子峰可以推測取代基的結構。與CID相比，HCD技術提供了穩(wěn)定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中產(chǎn)生的cut-off效應。HCD裂解模式結合高分辨質譜數(shù)據(jù)，為推測化合物結構、質譜裂解機制等提供更為詳實的裂解碎片信息，為化合物的確證提供可靠的理論依據(jù)。該質譜裂解規(guī)律可以應用于SA及其類似物的質譜分析，對SA及其類似物的快速篩選鑒別、定量分析和藥動學研究起到一定的參考作用。

[1] Pichler P, Kcher T, Holzmann J, et al. Peptide labeling with isobaric tags yields higher identification rates using iTRAQ 4-plex compared to TMT 6-plex and iTRAQ 8-plex on LTQ Orbitrap[J]. Anal Chem, 2010, 82(15): 6549-6558.

[2] Lu Y, Shen Q, Dai Z, et al. Development of an on-line matrix solid-phase dispersion/fast liquid chromatography/tandem mass spectrometry system for the rapid and simultaneous determination of 13 sulfonamides in grass carp tissues[J]. J Chromatogr A, 2011, 1218(7): 929-937.

[3] 孫慶慶, 王敏, 沈淑嬌, 等. 三唑類席夫堿的綠色合成和生物活性研究[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2012, 42(3): 218-223．

[4] 謝自新, 張園, 蔡進章, 等. 菜頭腎脂溶性成分研究[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2011, 41(4): 376-379．

[5] Liu X, Zhou Y, Chen H, et al. Detection of carbonyl groups in triterpenoids by hydroxylamine hydrochloride derivatization using electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22(12): 1981-1992.

[6] Liu X, Li SL, Zhou Y, et al. Characterization of protostane triterpenoids in Alisma orientalis by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2010,24(11): 1514-1522.

[7] Skrabáková Z, O'Halloran J, van Pelt FN, et al. Food contaminant analysis at ultra-high mass resolution: application of hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometry for the determination of the polyether toxins, azaspiracids, in shellfish[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2010, 24(20):2966-2974.

[8] Godfrey AR, Williams CM, Dudley E, et al. Investigation of uremic analytes in hemodialysate and their structural elucidation from accurate mass maps generated by a multi-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry approach[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(19):3194-3204.

[9] Chi H, Sun RX, Yang B, et al. pNovo: de novo peptide sequencing and identification using HCD spectra[J]. J Proteome Res, 2010, 9(5): 2713-2724.

[10]Shen Y,Toli? N, Xie F, et al. Effectiveness of CID, HCD,and ETD with FT MS/MS for degradomic-peptidomic analysis: comparison of peptide identification methods[J]. J Proteome Res, 2011, 10(9): 3929-3943.

[11]Bushee JL, Argika UA. An experimental approach to enhance precursor ion fragmentation for metabolite identification studies: application of dual collision cells in an orbital trap[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25(10): 1356-1362.

[12]Demesa Balderrama G, Meneses EP, Hernández Orihuela L,et al. Analysis of sulfated peptides from the skin secretion of the Pachymedusa dacnicolorfrog using IMAC-Ga enrichment and high-resolution mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25(8): 1017-1027.

[13]Sousa E, Olland S, Shih HH, et al. Primary sequence determination of a monoclonal antibody againstα-synuclein using a novel mass spectrometry-based approach[J]. Int J Mass spectrom, 2012, 312: 61-69.

[14]Monaci L, De Angelis E, Visconti A. Determination of deoxynivalenol, T-2 and HT-2 toxins in a bread model food by liquid chromatography-high resolution-Orbitrap-mass spectrometry equipped with a high-energy collision dissociation cell[J]. J Chromatogr A, 2011, 18(48): 8646-8654.

[15] Li JH, Liu X, Han S, et al. Analysis of ochratoxin A in wine by high-resolution UHPLC-MS[J]. Food Anal Methods,2012, 5 (6): 1506-1513.

[16] Liu X, Yang JL, Li JH, et al. Analysis of water-soluble azo dyes in soft drink by high resolution UPLC-MS[J]. Food Addit Contam, 2011, 28 (10): 1315-323.

[17] 嚴華, 劉鑫, 李建輝, 等. 氟喹諾酮類藥物的高能誘導裂解高分辨質譜解析[J]. 檢驗檢疫學刊, 2011, 21(增刊): 87-91.

[18]Kuki A, Nagy L, Memboeuf A, et al. Energy-dependent collision-induced dissociation of lithiated polytetrahydrofuran:effect of the size on the fragmentation properties[J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2010, 21(10): 1753-1761.

[19]Volmer DA. Multiresidue determination of sulfonamide antibiotics in milk by short-column liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 1996, 10(13): 1615-1620.

[20]Wang Z, Hop CE, Kim MS, et al. The unanticipated loss of SO2from sulfonamides in collision-induced dissociation[J].Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(1): 81-86.

[21]Wang HY, Zhang X, Guo YL, et al. Sulfonamide bond cleavage in benzenesulfonamides and rearrangement of the resulting p-aminophenylsulfonyl cations: application to a 2-pyrimidinyloxybenzyl- aminobenzenesulfonamide herbicide[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19(12): 1696-1702.

[22]Klagkou K, Pullen F, Harrison M, et al. Approaches towards the automated interpretation and prediction of electrospray tandem mass spectra of non-peptidic combinatorial compounds[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(11): 1163-1168.

[23]Barry SJ, Wolff JC. Identi fication of isobaric amino-sulfonamides without prior separation[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2012, 26(4): 419-429.

[24]彭濤. 電噴霧串聯(lián)質譜裂解規(guī)律及其在殘留分析中的應用研究[D]. 中國農(nóng)業(yè)大學, 2007.

[25] 馬強, 王超, 王星, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定化妝品中的22種磺胺類藥物[J]. 分析化學, 2008, 36(12):1683-1689.

[26] 董丹, 邵兵, 吳永寧, 等. 液相色譜電噴霧串聯(lián)四極桿質譜法測定雞肉中17種磺胺類藥物的殘留[J]. 色譜, 2005, 23(4):404-407.

[27] 吳轉璋, 丁健樺, 賴勁虎, 等. 紡織品中偶氮染料還原液內芳香胺的電噴霧電離質譜分析[J]. 巖礦測試, 2008, 27(4): 250-254.