施翔翔， 高瞻， 伍新雷， 黃周青， 楊德業(yè)，2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 杭州 310015）

原發(fā)性高血壓即高血壓病是老年人最常見(jiàn)的心血管疾病之一，近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果表明：原發(fā)性高血壓是一種多基因疾病，可能存在多個(gè)“微效基因”的聯(lián)合缺陷[1-2]。FXYD蛋白家族最近被證明是一個(gè)組織特異性調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase的小跨膜蛋白家族[3]。我們之前的研究表明在阻力血管（腸系膜動(dòng)脈第二、第三級(jí)分支）和腎臟組織FXYD5基因表達(dá)水平在13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）組比Wistar大鼠（WKY）組下調(diào)14.8倍[4-5]，提示FXYD5可能在高血壓發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近幾年才被認(rèn)識(shí)的自然界進(jìn)化保守而普遍存在的一種現(xiàn)象[6]，目前廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究和基因表達(dá)調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)選擇RNAi技術(shù)特異性沉默其在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，研究該高血壓相關(guān)基因的沉默對(duì)血管平滑肌細(xì)胞所造成的一系列影響，包括增殖能力、遷移能力及Na+-K+-ATPase的活性改變，為探索高血壓病新的致病基因及其發(fā)病機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM、0.05%胰酶/EDTA、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、DEPC水均購(gòu)自Invitrogen公司；RT試劑盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）購(gòu)自立陶宛Fermantas公司；Power SYBR?Green PCR試劑盒購(gòu)自ABI公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；超微量Na+-K+-ATPase測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Triton X 100溶液購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株（rat thoracic aorta smooth muscle cells A7r5，CRL-1444），購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。接種于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，平均每3 d進(jìn)行胰酶消化法傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 設(shè)計(jì)合成FXYD5特異的siRNA片段：siRNA片段由上海吉瑪公司合成，分別命名為siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。siRNA-con與大鼠基因組各基因均無(wú)明顯同源性。各序列分別為：siRNA-1正義鏈5’-GAGUUCUGUGACUACUCAUTT-3’，反義鏈5’-AUGAGUAGUCACAGAACUCTG-3’；siRNA-2正義鏈5’-CG AAAUGGCCACUGCGAAUTT-3’，反義鏈5’-AUUCGCAGUGGC CAUUUCGTT-3’；siRNA-3正義鏈5’-ACUUACAAGCAGCGA GAAATT-3’，反義鏈5’-UUUCUCGCUGCUUGUAAGUTT-3’；siRNA-4正義鏈5’-GGAAUUAUCAUCCUCACUATT-3’，反義鏈5’-UAGUGAGGAUGAUAAUUCCAG-3’；siRNA-con正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈5’-AC GUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3.2 轉(zhuǎn)染及篩選高效干擾的siRNA片段：用FAMNC siRNA/Lipofectamine 2000（2.5μL/2.5μL）轉(zhuǎn)染CRL-1444細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞，獲得滿意轉(zhuǎn)染效率后，轉(zhuǎn)染各siRNA片段，48 h后各組以Trizol、RT試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參照。設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增引物：FXYD5上游引物（5’to 3’）gggtggtattgtcgtagtagaagg，下游引物（5’to 3’）atgtcaccgcccagtcag，產(chǎn)物長(zhǎng)度：423 bp；GAPDH上游引物（5’to 3’）CATGGTCTACATGTCCAGT，下游引物（5’to 3’）GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC，產(chǎn)物長(zhǎng)度：346 bp；α1亞單位上游引物（5’to 3’）TGCCTTCCCCTACTCCCTTCTCATC，下游引物（5’to 3’）CTTCCCCGCTGTCGTCCCCGTCCAC，產(chǎn)物長(zhǎng)度：323 bp。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，在Biorad凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察目的條帶。

1.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)干擾后FXYD5 mRNA表達(dá)水平：于NCBI網(wǎng)站查找大鼠FXYD5及GAPDH的基因序列，通過(guò)Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成引物。FXYD5正向引物5’-CCTAGTGAAGGGCAGACACCAG-3’，反向引物5’-TGGCCATTTCGGTCAGTTG-3’；GAPDH正向引物5’-GTCATCATCTCCGCCCCTT-3’，反向引物5’-TTCTGAGTGGCAGTGATGGC-3’。以15μL反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，包括：1μL cDNA，7.5μL 2×Power SYBR?Green PCR Mix，0.5μL前向引物，0.5μL后向引物。實(shí)時(shí)定量PCR條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40循環(huán)。所有樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增產(chǎn)物單一性。通過(guò)比較ΔCt的方法進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析[7]。以GAPDH為內(nèi)參，F(xiàn)XYD5在實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的mRNA表達(dá)水平的比值=2-（ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt空白對(duì)照組），ΔCt=CtmRNA-CtGAPDH。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以5000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板，24 h后分別轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-con對(duì)照組、空白對(duì)照組4組；37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將CCK-8與無(wú)血清DMEM以1:9混合，各孔加入100μL混合液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，邊緣孔用DMEM填充避免邊緣效應(yīng)；繼續(xù)37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀470 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度值并記錄，參比波長(zhǎng)650 nm。

1.3.5 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移力：常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞，接種6孔板轉(zhuǎn)染各組并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后；每孔加入2 mL無(wú)血清DMEM同步化24 h；用無(wú)菌1000μL槍頭（直徑約1 mm）在各孔細(xì)胞生長(zhǎng)單層的相同位置劃平行直線，造成“傷口”；加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；4%甲醛固定20 min及1% Triton X-100作用5 min；蘇木精染色5 min后顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野拍攝（×40），軟件（Image-Pro Plus，v6.0）測(cè)量遷移距離最遠(yuǎn)的細(xì)胞到起始處的距離，計(jì)算均值。

1.3.6 血管平滑肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性檢測(cè)：嚴(yán)格按照南京建成超微量Na+-K+-ATPase測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Na+-K+-ATPase可分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷，根據(jù)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可判斷ATP酶活力的高低?？梢?jiàn)分光光度計(jì)636 nm處測(cè)吸光度值。規(guī)定每小時(shí)每毫克細(xì)胞蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位。公式：ATPase活力（U/mgprot）=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度×6*×7.8**÷勻漿蛋白含量（mgprot/mL），其中6*：定義上為每小時(shí)，實(shí)際操作為10 min酶促反應(yīng)；7.8**：反應(yīng)體系中為7.8倍稀釋。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，以±s表示，多組間均數(shù)比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染及篩選高效干擾的siRNA片段結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞，以綠色熒光細(xì)胞數(shù)與自然光下細(xì)胞總數(shù)的比值估算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率在80%以上（見(jiàn)圖1）。RT-PCR初篩RNAi效率（見(jiàn)圖2）：目的條帶位于400～500 bp左右與引物設(shè)計(jì)時(shí)的PCR產(chǎn)物片段大小符合，篩選出siRNA-1和siRNA-2兩實(shí)驗(yàn)組做隨后實(shí)驗(yàn)。

圖1 CRL-1444轉(zhuǎn)染攜帶FAM基團(tuán)的siRNA 48 h后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。綠色熒光代表成功轉(zhuǎn)染的平滑肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率約為80%

圖2 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 特異性干擾后FXYD5 mRNA表達(dá)水平 熔解曲線分析顯示FXYD5和GAPDH的PCR產(chǎn)物特異性高，無(wú)雜帶（見(jiàn)圖3）。FXYD5和GAPDH的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4，橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為ΔRn，Rn表示第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光值，紅線為熒光閾值。轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-con對(duì)照組與空白對(duì)照組的相對(duì)比值分別為0.133±0.116、0.098±0.072和1.003±0.262。siRNA-1使FXYD5的mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比下降86.71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；siRNA-2使FXYD5的mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比下降90.17%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；siRNA-con對(duì)照組與空白對(duì)照組FXYD5的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.996）。

圖3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物熔解曲線

圖4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線

2.3 特異性干擾FXYD5對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-con對(duì)照組的吸光光度值分別為1.040±0.141、1.097±0.206和1.062±0.111，與空白對(duì)照組的1.184±0.152比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。特異性干擾沉默F(xiàn)XYD5對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖無(wú)影響。

2.4 沉默F(xiàn)XYD5對(duì)平滑肌細(xì)胞遷移能力的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2的平滑肌細(xì)胞遷移距離（μm）分別為188.098±9.900、180.247±25.497，較siRNA-con對(duì)照組的245.690±24.438和空白對(duì)照組的250.866±21.887顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染48 h后各組CRL-1444細(xì)胞的遷移情況（×40）

2.5 沉默F(xiàn)XYD5對(duì)平滑肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響 轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2的Na+-K+-ATPase活性（U/mgprot）分別為2.894±0.170、2.944±0.060，較空白對(duì)照組的4.006±0.048顯著降低（P＜0.01），較siRNA-con對(duì)照組的3.587±0.064亦顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)各組CRL-1444細(xì)胞增殖能力的影響

表2 轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)各組細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響

3 討論

RNAi現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默的過(guò)程。RNAi具有特異、有效的基因沉默效應(yīng)，克服了建立基因敲除動(dòng)物模型費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，已成為基因功能分析和基因治療的重要手段。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用化學(xué)合成法，嚴(yán)格設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)針對(duì)不同F(xiàn)XYD5基因mRNA序列區(qū)域的siRNA（siRNA-1～4）及采用公認(rèn)的通用陰性對(duì)照來(lái)盡量避免脫靶效應(yīng)，高效率地瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，之后通過(guò)RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證4個(gè)片段的抑制效率，發(fā)現(xiàn)siRNA-1和siRNA-2特異性地抑制了FXYD5基因mRNA水平的表達(dá)，抑制率分別達(dá)到86.71%和90.17%。以上結(jié)果說(shuō)明我們?cè)谠O(shè)計(jì)的4個(gè)siRNA片斷中成功篩選出2個(gè)能夠有效抑制FXYD5基因表達(dá)的siRNA序列，為今后構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，獲得FXYD5穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)。

FXYD蛋白家族是一類Na+-K+-ATPase的組織特異性調(diào)節(jié)因子。這些蛋白具有一個(gè)特征性的FXYD基序，兩個(gè)保守的甘氨酸殘基和一個(gè)絲氨酸殘基。FXYD5在結(jié)構(gòu)上不同于其他的FXYD家族成員，它的胞外段氨基酸超過(guò)140個(gè)，明顯長(zhǎng)于其他FXYD蛋白胞外端的40個(gè)氨基酸，并且它的胞內(nèi)段只有15個(gè)氨基酸[8-9]。Lubarski等[10]的系列研究證明FXYD5和Na+-K+-ATPase之間存在相互作用，能明顯增加鈉泵的構(gòu)型的轉(zhuǎn)變的效率，在爪蟾卵中FXYD5/FXYD4嵌合表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明它們與鈉泵的高親和力以及它的Vmax的增加都是通過(guò)FXYD5的跨膜區(qū)域介導(dǎo)的，其中已經(jīng)證明的幾個(gè)相關(guān)氨基酸有Ala150、Ile160和Leu161。

本實(shí)驗(yàn)室已研究表明：在阻力血管（腸系膜動(dòng)脈第二、第三級(jí)分支）和腎臟組織FXYD5基因表達(dá)水平在13周齡的SHR組比WKY組下調(diào)14.8倍[5]，提示FXYD5可能是高血壓新的相關(guān)基因。我們進(jìn)一步對(duì)相同周齡的WKY和SHR的腎組織和肺組織中的FXYD5的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)在4周、8周即處于高血壓前期的SHR和WKY的腎組織中FXYD5的表達(dá)沒(méi)有差異，而在13周即處于高血壓形成進(jìn)展期的SHR的腎組織其表達(dá)明顯低于WKY[11]。對(duì)于FXYD5在高血壓的發(fā)生發(fā)展中扮演什么角色目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAi技術(shù)特異性沉默F(xiàn)XYD5在大鼠平滑肌細(xì)胞的表達(dá)，模擬了SHR大鼠體內(nèi)低FXYD5表達(dá)的環(huán)境，發(fā)現(xiàn)FXYD5的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性明顯下降。而Na+-K+-ATPase作為真核細(xì)胞膜上的糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞，對(duì)血管緊張性、心肌收縮、細(xì)胞增殖和死亡等產(chǎn)生重要影響[12]。已有研究證明高血壓病患者及SHR大鼠體內(nèi)鈉泵活性降低[13]，且發(fā)現(xiàn)高血壓病患者子女的鈉泵活性也降低，提示高血壓病的高度遺傳傾向[14]。眾所周知，血管重塑既是高血壓發(fā)生的病理基礎(chǔ)，也是高血壓維持、進(jìn)展的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。高血壓血管結(jié)構(gòu)改變被證實(shí)與血管細(xì)胞的增殖、遷移有關(guān)[15]。高血壓血管重構(gòu)主要表現(xiàn)為管壁增厚，血管壁/腔比例加大，血流阻力和血管反應(yīng)性增加。中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移并增殖是包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等在內(nèi)的血管重構(gòu)的重要發(fā)生機(jī)制之一。Hsieh等[16]報(bào)道在血清和血小板衍化生長(zhǎng)因子等因子的趨化作用下，SHR中膜VSMC遷移快于WKY。這一現(xiàn)象不僅見(jiàn)于血壓已明顯升高的20周齡SHR，而且也見(jiàn)于高血壓前期的5周齡SHR，提示不僅血管平滑肌細(xì)胞增殖而且細(xì)胞遷移也可能參與高血壓血管重塑機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的另一結(jié)果也發(fā)現(xiàn)抑制FXYD5的表達(dá)并不影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖，但能使其遷移能力下降，即FXYD5表現(xiàn)出一種抗黏附的作用，提示FXYD5可能通過(guò)影響血管重塑在高血壓病進(jìn)展期發(fā)揮一定的代償作用。

綜上所述，F(xiàn)XYD5在血管平滑肌細(xì)胞中的低表達(dá)能影響血管重塑，抑制鈉泵活性，從而在高血壓形成過(guò)程中扮演重要角色，可能是高血壓病新的相關(guān)基因之一，為進(jìn)一步探索高血壓的發(fā)病機(jī)制及基因治療開(kāi)辟了嶄新的途徑。

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