劉俊，徐航，葛衛(wèi)紅，陳小芳 （．皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院藥劑科，安徽 蕪湖400；．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京0008）

華法林（warfarin）是20世紀(jì)40年代美國Wisconsin大學(xué)合成的臨床最常用的防治血栓栓塞的口服抗凝藥，因其具有抗凝和溶栓雙重調(diào)節(jié)作用、療效顯著、作用持續(xù)時間長、服用方便、價格低廉而應(yīng)用于心臟人工瓣膜置換術(shù)后、非瓣膜性心房纖顫或心房撲動、肺栓塞以及深靜脈血栓抗凝的治療。因華法林血藥濃度與療效存在明顯個體差異、藥物安全范圍窄且存在較多的影響因素，故華法林的臨床治療劑量不易掌握。華法林用量不足容易形成血栓，使用過量可增加出血風(fēng)險。較為科學(xué)的給藥方式是通過監(jiān)測患者的凝血酶原時間－國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（PT－INR），將INR控制在理想的抗凝強度范圍內(nèi)，而達(dá)到抗血栓且不增加出血風(fēng)險的目的。

近年來，隨著遺傳藥理學(xué)和華法林基因多態(tài)性研究日益成熟，遺傳因素與華法林個體劑量的關(guān)系得到廣泛認(rèn)可，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2007年8月要求將細(xì)胞色素P4502C9（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1（VKORC1）基因型檢測納入華法林說明書中的警示信息欄內(nèi)，醫(yī)藥界開始不斷嘗試通過對患者進(jìn)行基因型檢測，以求建立華法林個體化給藥模型，如Wen模型［1］、Ohno模型［2］等。通過基于藥物基因組學(xué)的華法林個體化給藥模型以確定華法林抗凝治療的適宜劑量，達(dá)到個體化給藥［3］目的。此外，國際華法林藥物基因組聯(lián)合會（international warfarin pharmaeogenetics consortium，IWPC）收集了5 700例來自4大洲9個國家的21個研究機構(gòu)使用華法林達(dá)到穩(wěn)定臨床療效的患者信息，并建立數(shù)據(jù)庫。Klein等［4］對此數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選和驗證，建立了IWPC模型，是目前涉及病例規(guī)模最大的模型。通過對心臟瓣膜手術(shù)患者進(jìn)行基因檢測，并利用IWPC模型計算出華法林預(yù)測劑量，同時對患者進(jìn)行PTINR監(jiān)測，可以依據(jù)監(jiān)測結(jié)果調(diào)整華法林至穩(wěn)定劑量，并比較華法林的預(yù)測劑量與穩(wěn)定劑量的差異，以了解基因檢測在確定華法林合適劑量中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選取南京鼓樓醫(yī)院心胸外科2012年1月－2012年6月行心臟瓣膜手術(shù)患者425例，記錄患者基本信息，包括性別、年齡、體質(zhì)量、身高、體質(zhì)量指數(shù)、體表面積、瓣膜手術(shù)類型、肝腎功能、合并用藥和疾病狀態(tài)等。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡≥18歲，漢族人；華法林均需達(dá)到穩(wěn)定劑量，即華法林連續(xù)服用時間≥3個月，連續(xù)4次INR達(dá)目標(biāo)抗凝強度，監(jiān)測間隔時間至少為1周。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：心功能Ⅲ級或以上；肝功能不全，血清轉(zhuǎn)氨酶大于正常值3倍或膽紅素大于正常值2倍；腎功能不全，血清肌酐值≥200μmol·L－1；嚴(yán)重營養(yǎng)不良；妊娠期婦女；甲狀腺功能異常者。

按照預(yù)先設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，共納入407例患者，將其隨機分為對照組和試驗組，試驗組在進(jìn)行華法林抗凝治療前給予基因型檢測。

1．2 抗凝標(biāo)準(zhǔn) 采用低強度抗凝標(biāo)準(zhǔn)，其中瓣環(huán)植入、生物瓣膜置換、主動脈瓣機械瓣置換（aortic valve replacement，AVR）INR控制在1．6～2．2，二尖瓣機械瓣置換（mitral valve replacement，MVR）、主動脈瓣及二尖瓣雙瓣機械瓣置換（double valve replacement，DVR）INR控制在1．8～2．5。

1．3 抗凝治療 所有患者術(shù)后24～48 h開始給予華法林（芬蘭奧立安藥業(yè)，3．0mg·片－1）抗凝治療。對照組按照患者體質(zhì)量確定華法林初始劑量為3．0～4．5 mg·d－1，試驗組根據(jù)“基因檢測報告”中患者基因型并結(jié)合美國FDA建議的華法林初始劑量確定華法林首次劑量，見表1。瓣環(huán)植入、生物瓣置換、AVR患者采取就低原則，MVR、DVR患者采取就高原則?！盎驒z測報告”結(jié)果建議的初始劑量為3．0～4．0mg·d－1，瓣環(huán)植入、生物瓣置換、AVR患者服用3．0mg·d－1，MVR、DVR患者服用3．75 mg·d－1。

表1 美國FDA建議的華法林初始劑量（mg·d－1）Tab 1 The initial doses of warfarin recommended by FDA in USA （mg·d－1）

對照組華法林口服第2天開始每日監(jiān)測PTINR值，依據(jù)監(jiān)測結(jié)果調(diào)整華法林劑量至目標(biāo)抗凝強度。試驗組華法林自第2劑開始按“基因檢測報告”預(yù)測劑量，采用就近原則服用，維持劑量服用2劑后，每日監(jiān)測PT－INR值，并根據(jù)INR值調(diào)整華法林劑量。舉例：“基因檢測報告”結(jié)果預(yù)測劑量為3．15 mg·d－1，則患者實際應(yīng)服用3．0mg·d－1，2 d后根據(jù)INR值進(jìn)行劑量調(diào)整；“基因檢測報告”結(jié)果預(yù)測劑量為3．65 mg·d－1，則患者實際應(yīng)服用3．75 mg·d－1，2 d后根據(jù)INR值進(jìn)行劑量調(diào)整。

1．4 基因型檢測 取外周靜脈血2 mL，－20℃保存；利用全血基因組抽提試劑盒（上海百傲科技有限公司，BST01010）提取患者基因組DNA，－20℃冷凍保存；分批將提取好的基因組DNA進(jìn)行CYP2C9＊3、VKORC1－1639位點聚合酶連反應(yīng)（PCR），對所需片段進(jìn)行擴增，采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）方法和測序技術(shù)對患者進(jìn)行基因檢測，并利用BE－2．0基因圖象分析軟件（軟件登記號：2002SR3064）確定患者基因分型。

1．5 模型驗證［5］比較試驗組和對照組住院期間華法林抗凝治療時間、華法林用藥3，5，7 d及出院前INR達(dá)標(biāo)率、藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況以及華法林穩(wěn)定劑量。將試驗組患者的基因型和其他信息代入IWPC給藥方程中，計算華法林預(yù)測周劑量（mg·wk－1），再進(jìn)一步確定華法林預(yù)測日劑量（mg·d－1）。比較華法林預(yù)測日劑量與華法林穩(wěn)定日劑量的差值，包括絕對差值和百分絕對差值。其中絕對差值＝預(yù)測劑量－穩(wěn)定劑量；百分絕對差值＝（預(yù)測劑量－穩(wěn)定劑量）／穩(wěn)定劑量×100%。以華法林穩(wěn)定劑量為縱坐標(biāo)，華法林預(yù)測劑量為橫坐標(biāo)作散點圖，并得到擬合直線，對華法林穩(wěn)定劑量與預(yù)測劑量進(jìn)行相關(guān)性分析并以擬合指數(shù)R2作為判斷模型準(zhǔn)確性的指標(biāo)，R2小于0．50提示模型準(zhǔn)確性較差。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行各項統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，進(jìn)行t檢驗，計數(shù)資料以頻數(shù)表示，研究對象 Hardy－Weinberg遺傳平衡的符合程度、組間基因型及等位基因頻率等計數(shù)資料的比較進(jìn)行χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并采用線性回歸分析比較華法林穩(wěn)定劑量與預(yù)測劑量的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2．1 患者基本情況 試驗組203例（49．88%），對照組204例（50．12%），2組患者基本信息比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2。

表2 試驗組和對照組患者基本信息（±s）Tab 2 The general information of patients in the test group and the control group（±s）

表2 試驗組和對照組患者基本信息（±s）Tab 2 The general information of patients in the test group and the control group（±s）

患者基本信息 試驗組（n＝203）對照組（n＝204） t／χ2P性別／男／女 95／108 94／110 0．021 0．884年齡／歲 53．59±12．13 51．60±13．04 1．592 0．112身高／cm 163．58±7．95 163．19±8．15 0．489 0．625體質(zhì)量／kg 61．51±11．23 61．78±11．64 0．233 0．816體質(zhì)量指數(shù)／kg·m－2 23．07±4．09 23．10±3．53 0．095 0．924體表面積／m2 1．63±0．18 1．63±0．18 0．043 0．966瓣環(huán)植入／例／% 46（22．66） 41（20．10） 1．107 0．893生物瓣置換／例／% 50（24．63） 45（22．06） 1．107 0．893 AVR／例／% 31（15．27） 35（17．15） 1．107 0．893 MVR／例／% 39（19．21） 42（20．59） 1．107 0．893 DVR／例／% 37（18．23） 41（20．10） 1．107 0．893

2．2 基因檢測結(jié)果 按照患者CYP2C9＊3基因型不同分為AA（＊1／＊1）型和 AC（＊1／＊3）型，VKORC1－1639G／A基因型分為 AA型、GA型和GG型，所有基因分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡（P＞0．05），見表3。

表3 CYP2C9＊3和VKORC1－1639基因型與等位基因的頻率分布（例，%）Tab 3 Allelic frequency and genotypic frequency of CYP2C9＊3 and VKORC1－1639（cases，%）

2．3 華法林抗凝治療結(jié)果 隨著抗凝治療時間的延長，INR達(dá)標(biāo)率逐漸上升，且試驗組INR在抗凝治療3，5 d及出院前達(dá)標(biāo)率均明顯高于對照組（P＜0．01），但兩組華法林總的用藥時間和華法林穩(wěn)定劑量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。住院期間兩組患者均未出現(xiàn)血栓栓塞事件，試驗組發(fā)生輕度出血2例，其中皮下出血1例，鼻出血1例，對照組出現(xiàn)3例鼻出血，給予對癥處理后好轉(zhuǎn)。2組患者華法林抗凝治療情況見表4，圖1。

表4 2組患者華法林抗凝治療基本情況（±s）Tab 4 The general situation of warfarin anticoagulation in the two groups（±s）

表4 2組患者華法林抗凝治療基本情況（±s）Tab 4 The general situation of warfarin anticoagulation in the two groups（±s）

觀察指標(biāo) 試驗組（n＝203）對照組（n＝204） t／χ2P用藥天數(shù)／d 10．44±5．68 9．96±3．54 1．030 0．304華法林穩(wěn)定劑量／mg·d－1 3．00±1．23 3．05±1．01 0．439 0．661不良反應(yīng)／例／% 2（0．99） 3（1．47） 0．198 0．657

圖1 2組患者華法林抗凝治療不同時間點INR達(dá)標(biāo)率Fig 1 INR target rate of warfarin anticoagulation in different time of the two groups

試驗組華法林預(yù)測劑量為（3．36±0．77）mg·d－1，明顯高于華法林穩(wěn)定劑量（3．00±1．23）mg·d－1（t＝34．88，P＝0．000），其絕對差值為（0．83±0．61）mg·d－1，百分絕對差值為（37．36±48．51）%，且華法林預(yù)測劑量與穩(wěn)定劑量存在相關(guān)性（P＝0．000，r＝0．332，R2＝0．110），其相關(guān)性曲線見圖2。

3 討論

圖2 華法林模型預(yù)測劑量與穩(wěn)定劑量的相關(guān)性（n＝203，P＝0．000，R2Linear＝0．11）Fig 2 The correlation diagram of warfarin prediction doses and stability doses（n＝203，P＝0．000，R2Linear＝0．11）

3．1 CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性與華法林個體劑量關(guān)系 華法林在體內(nèi)主要通過肝臟CYP2C9代謝為無活性的6－和7－羥基化合物。CYP2C9基因存在野生型CYP2C9＊1和變異型CYP2C9＊2～CYP2C9＊13［6］，其中與華法林代謝最密切基因突變型為CYP2C9＊2和CYP2C9＊3。CYP2C9＊2和CYP2C9＊3變異可使CYP2C9酶活性降低，華法林的代謝及消除減少而導(dǎo)致發(fā)生出血癥狀。研究表明［7－8］，攜帶 CYP2C9＊2或 CYP2C9＊3等位基因的患者較攜帶CYP2C9＊1／＊1的患者，華法林日均劑量明顯減少（P＜0．000 1），華法林過量的發(fā)生率較高。

VKORC1對凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和抗凝蛋白C、S的活化起關(guān)鍵作用，華法林為VKORC1特異性抑制劑，阻礙維生素K由環(huán)氧化物轉(zhuǎn)化為氫醌型，阻斷凝血因子的活化而發(fā)揮抗凝作用。VKORC1主要由VKORC1基因編碼，VKORC1在其啟動子區(qū)存在－1639G／A 及－1173C／T 位點多態(tài)性，這兩個多態(tài)性位點與華法林劑量的個體差異有密切關(guān)系。國內(nèi)外研究資料表明［9－10］，VKORC1的基因多態(tài)性對華法林劑量及維持時間均有明顯影響（P＜0．05）。

3．2 CYP2C9和VKORC1基因突變頻率CYP2C9和VKORC1基因突變頻率存在明顯民族和種族分布差異。CYP2C9＊2和CYP2C9＊3等位基因突變頻率在高加索人群中較高，分別達(dá)到8%～20%和6%～10%，而在亞洲人群中比較少，CYP2C9＊2的突變型稀有或缺失，CYP2C9＊3的突變型也僅有1%～4%［11］。本次研究發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中，CYP2C9＊3以野生型（AA型）為主，占總數(shù)的95．07%，CYP2C9＊3基因突變型（AC型）頻率為4．93%，略高于文獻(xiàn)報道，未檢測到CYP2C9＊2的突變型。亞洲人VKORC1基因型以－1639AA型和－1173TT型為主。Yang等［12］研究顯示，亞洲人群 VKORC1－1639AA、GA、GG基因型頻率分別為80．4%，18．3%和1．3%，而西方高加索人群分別為16．3%，48．9% 和36．7%；VKORC1－1173TT、CT、CC 基因型頻率分別為81．8%，16．8%，1．4%，高加索 人分別 為17．3%，47．4% 和33．5%。顧強等［13］研究表明，中國重慶地區(qū)漢族人VKORC1－1639AA型為86%，GA和 GG分別為12% 和 2%。結(jié)果顯示，VKORC1－1639AA 型81．77%，GA 型17．24%，GG 型0．99%，與文獻(xiàn)報道［12－13］基本一致。

3．3 華法林基于基因檢測個體化給藥評估 華法林預(yù)測劑量與穩(wěn)定劑量雖存在一定相關(guān)性，但也存在差異，預(yù)測劑量明顯高于穩(wěn)定劑量（P＝0．000），其絕對差值為（0．83±0．61）mg·d－1，百分絕對差值為（37．36±48．51）%，高于國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道［5］。R2值為0．11，表明本研究對納入對象采用IWPC模型預(yù)測華法林穩(wěn)定的給藥劑量準(zhǔn)確性較差，且由表4可知，試驗組和對照組華法林抗凝治療時間、華法林穩(wěn)定劑量及不良反應(yīng)發(fā)生率均無明顯差異（P＞0．05），但有意義的是試驗組華法林在治療3，5 d和出院前的INR達(dá)標(biāo)率明顯高于對照組（P＜0．01），尤其是在華法林治療前5 d，INR達(dá)標(biāo)率明顯提高（P＝0．000），這可以減少因僅憑患者體質(zhì)量值確定華法林首次劑量帶來的治療盲目性，上述結(jié)果提示患者基因型檢測對于指導(dǎo)華法林抗凝治療具有一定的臨床意義，尤其在確定華法林初始治療劑量，提高華法林初始治療抗凝達(dá)標(biāo)率方面具有指導(dǎo)意義。

華法林預(yù)測劑量與穩(wěn)定劑量存在偏差，可能與IWPC模型納入人群的基本特征背景與本研究人群的基本特征背景存在差異有關(guān)。IWPC模型具有明確的種族特征，其納入的主要人群為高加索人，由于基因型、飲食習(xí)慣及地域分布不同，亞洲人對華法林的敏感性顯著高于高加索人，達(dá)到相同抗凝強度亞洲人所需的華法林劑量要低于高加索人［4－5］。另外，IWPC模型采用中等強度抗凝標(biāo)準(zhǔn)，其INR值為2．0～3．0（目標(biāo)值2．5），而本次研究采用的是低強度抗凝標(biāo)準(zhǔn)，這可能是導(dǎo)致華法林預(yù)測劑量明顯高于華法林穩(wěn)定劑量的另一原因。本次研究僅檢測了患者CYP2C9、VKORC1基因型，研究表明［14］，華法林的抗凝療效還受到CYP4F2、CYP2A6、載脂蛋白E（ApoE）、γ谷氨酰羧化酶（GGCX）、多藥耐藥基因（MDR1）等基因的調(diào)控。因此，單憑 CYP2C9、VKORC1基因型確定華法林預(yù)測劑量可能是導(dǎo)致華法林預(yù)測劑量明顯高于華法林穩(wěn)定劑量的又一原因。此外，生活方式、生理病理狀態(tài)、藥物等非遺傳因素對華法林抗凝治療亦存在顯著影響［15］。如腹瀉、發(fā)熱、吸煙、飲酒等均可減弱華法林抗凝作用，而肝腎功能不全會影響機體對華法林的代謝和消除，導(dǎo)致華法林消除半衰期延長造成華法林體內(nèi)蓄積，從而增強其抗凝作用。此外，藥物相互作用亦可影響華法林的療效，非甾體抗炎藥如阿司匹林、布諾芬、塞來昔布等可提高華法林游離血藥濃度，增強抗凝作用；第二、三代頭孢菌素、甲硝唑、阿奇霉素、克拉霉素、氟喹諾酮類等可抑制腸道細(xì)菌產(chǎn)生維生素K，使維生素K生成和吸收減少，維生素K依賴性凝血因子的合成障礙，亦可增強華法林的抗凝作用；胺碘酮、氟康唑等通過抑制華法林體內(nèi)代謝而增強其抗凝作用；銀杏葉提取物、丹參、當(dāng)歸、紅花等活血化瘀類中藥制劑可抑制血小板聚集，與華法林產(chǎn)生協(xié)同抗血栓作用。

4 討論

盡管CYP2C9、VKORC1在解釋華法林個體差異起著關(guān)鍵作用，但仍有近50%的劑量差異無法得到解釋［16］。因此，F(xiàn)DA并未強制各醫(yī)療機構(gòu)在進(jìn)行華法林抗凝治療前開展此類基因檢測。本次研究亦發(fā)現(xiàn)單純依據(jù)基因檢測來確定華法林劑量存在一定偏差，還需結(jié)合其他臨床因素來確定華法林最終維持劑量，提高華法林抗凝治療的準(zhǔn)確性和有效性。由于納入的樣本量較小，基因檢測能否真正運用臨床為臨床治療提供科學(xué)理論依據(jù)還需大規(guī)模臨床驗證，以期建立適合漢族人的華法林個體化給藥模型，減少單憑臨床經(jīng)驗進(jìn)行抗凝治療的弊端，科學(xué)指導(dǎo)臨床進(jìn)行華法林抗凝治療，在發(fā)揮華法林抗凝作用同時，降低華法林抗凝過量帶來的出血風(fēng)險。

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