胡松，張耕，程璐 （武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢430022）

蔥白是百合科（Liliaceae）植物蔥AlliumfistulosumL．var．caespitosum Makino．的鱗莖。藥理學(xué)研究表明，蔥屬植物具有抗菌、抗腫瘤及防治心血管疾病等功效［1－3］，蔥白也不例外，以其為原料的相應(yīng)產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用有很好的前景［4－7］。與蔥屬植物大蒜相似，蔥白中存在著蒜氨酸酶以及與其相應(yīng)的有機(jī)硫化物底物，在蔥白細(xì)胞被破碎時(shí)二者即結(jié)合生成丙酮酸和硫代亞磺酸酯類物質(zhì)［8］。硫代亞磺酸酯類化合物是蔥屬各種植物中含硫化合物的前體物質(zhì)，也是該屬物質(zhì)中眾多生物活性的關(guān)鍵物質(zhì)。該物質(zhì)非常不穩(wěn)定，很容易分解為各種含硫化合物。因此對(duì)蔥白生物活性的研究及開發(fā)利用過程中，對(duì)含硫化合物的前體物質(zhì)研究則成了關(guān)鍵之一，所以對(duì)其起重要作用的蒜氨酸酶的研究具有重要的意義。

現(xiàn)階段，對(duì)蔥白同屬植物大蒜中蒜氨酸酶的研究已經(jīng)很深入，但是關(guān)于蔥白中酶的研究則鮮有報(bào)道。我們前期對(duì)蔥白進(jìn)行酶解和殺酶兩種不同方法處理后進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其所含的有機(jī)硫化合物種類和數(shù)量出現(xiàn)明顯差異［9］。雖然這兩種物質(zhì)中含硫化合物產(chǎn)生的原理相似，兩種酶的功能也有一定的相似性，但是不同的酶之間，在理化性質(zhì)及酶動(dòng)力學(xué)特性上存在著差別。因此對(duì)新鮮蔥白中提取的粗酶性質(zhì)進(jìn)行研究，可以為蔥白的功效及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

紫外－可見分光光度計(jì)（日本島津UV－1601）；勻漿機(jī)（九陽JYL－B011）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京市醫(yī)用離心機(jī)廠LGR10－4．2型）；電熱恒溫水浴鍋（武漢市琴臺(tái)醫(yī)療器械廠 HHS系列雙列4孔）；電子天平（德國賽多利斯BP310S d＝0．001 g）；電子天平（德國賽多利斯 ME215S d＝0．1 mg）。

新鮮小蔥（自種，經(jīng)華中科技大學(xué)藥學(xué)院張長弓副教授鑒定）；混合底物及粗酶（從新鮮蔥白中提取，本課題組自制，批號(hào)分別為20110517和20110728）；丙酮酸鈉（生化試劑Amresco，批號(hào)20110129）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2．1 測定波長的選擇 精密稱取丙酮酸鈉110．0 mg（1 mmol），置于100 mL量瓶中，用純化水稀釋至刻度；移取該濃度下的丙酮酸鈉溶液2 mL置于20 mL量瓶中，加入1 mL的2，4－二硝基苯肼試液（取2，4－二硝基苯肼試液100 mg，用2 mol·L－1的鹽酸溶液溶解，稀釋，定容至100 mL，搖勻，即得），搖勻，室溫放置5 min，使其充分反應(yīng)；再加入1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液5 mL，以純化水定容至刻度，放置20 min，用相應(yīng)的純化水和顯色劑做空白，在300～600 nm波長處進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果顯示，經(jīng)過顯色反應(yīng)后，丙酮酸分別在430 nm和520 nm處有最大吸收波長。但是在該反應(yīng)體系中，430 nm處吸收峰的吸光度值受氫氧化鈉濃度的影響較大［10］，而在520 nm處的吸光度值則較穩(wěn)定，所以選擇520 nm作為測定波長。

2．2 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取丙酮酸鈉55．16 mg，置于50 mL量瓶中，加入純化水超聲溶解，并定容至刻度線。取上述濃度樣品3 mL，置于50 mL量瓶中，并加水稀釋至刻度線。取分別取稀釋后的樣品0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0mL置于10 mL量瓶中，定容，即得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各樣品7 mL置于20 mL具塞刻度試管中，然后分別向試管中加入2，4－二硝基苯肼試液1 mL，室溫下反應(yīng)5 min，然后加入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，室溫下反應(yīng)20 min，在定波長520 nm下測定各管溶液的吸光度值，以反應(yīng)體系中丙酮酸的含量（X）對(duì)吸光度值（Y）作線性回歸。得回歸方程為Y＝5．419X＋0．012，r＝0．999 5，線性范圍為0．015～0．15μmol。

2．3 蔥白中粗制蒜氨酸酶活力的測定 精密稱取粗酶樣品于量瓶中，加水稀釋并定容，得終濃度為2．5 mg·mL－1的供試品溶液。精密吸取供試品溶液3 mL，加混合底物2 mL，在35℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，加入10%三氯醋酸溶液2 mL終止反應(yīng)。然后分別向試管中加入2，4－二硝基苯肼試液1 mL，室溫下反應(yīng)5 min，然后加入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，室溫下反應(yīng)20 min，在波長520 nm下測定溶液的吸光度值。將酶活力定義為在指定條件下，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的丙酮酸的量，以反應(yīng)速率V表示，單位為μmol／5 min。

2．4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 精密稱取粗酶樣品62．96 mg，加純化水稀釋定容至25 mL，即得樣品溶液。按照“2．5”項(xiàng)下的方法操作，分別測定酶促反應(yīng)進(jìn)行0．5，1．0，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0 min時(shí)的反應(yīng)速率。

2．5 溫度對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 分別測定酶促反應(yīng)溫度為10，20，30，35，40，50℃時(shí)的反應(yīng)速率。

2．6 pH值對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制成pH 值分別為3．0，4．0，5．0，6．0，7．0，8．0，9．0，10．0的緩沖溶液，用相應(yīng)緩沖液溶解粗酶樣品，分別測定不同pH值條件下的反應(yīng)速率。

2．7 金屬離子對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 分別配制2 mmol·L－1的Fe3＋，Ca2＋，Cu2＋，Zn2＋溶液，用相應(yīng)金屬離子溶液溶解粗酶樣品，分別測定不同金屬離子溶液中反應(yīng)速率。

2．8 不同滅活條件對(duì)蔥白粗制蒜氨酸酶活力的影響 分別測定微波處理5 min后，90℃高溫處理30 min后，甲醇溶解處理后的酶活，與未經(jīng)任何處理的樣品比較。

3 結(jié)果

3．1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 從圖1中可以看出，蔥白中蒜氨酸粗酶的酶促反應(yīng)非常劇烈，4 min內(nèi)反應(yīng)基本完成，4 min后反應(yīng)速率基本穩(wěn)定。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蒜氨酸酶活力的影響Fig 1 Effects of reaction time on the activity of alliinase

3．2 溫度對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 從圖2可以看出，30℃后，粗酶的活力顯著增加，在35℃附近達(dá)到最高峰，然后下降，40℃后又顯著下降。蔥白中蒜氨酸酶的最適溫度范圍為30～40℃，最適反應(yīng)溫度為35℃。

圖2 溫度對(duì)蒜氨酸酶活力的影響Fig 2 Effects of temperature on the activity of alliinase

3．3 pH值對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 從圖3可以看出pH值為6．0～8．0范圍內(nèi)時(shí)，蒜氨酸酶活力所受到的影響并不是很大。這一點(diǎn)說明，pH值在該范圍時(shí)，比較適宜進(jìn)行酶促反應(yīng)。在這個(gè)范圍外的酶活力顯著下降，在該范圍內(nèi)，最適的pH值為6．2。

圖3 pH值對(duì)蒜氨酸酶活力的影響Fig 3 Effects of pH value on the activity of alliinase

3．4 金屬離子對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 從圖4可以看出，與純化水組相比，F(xiàn)e3＋、Cu2＋和Zn2＋對(duì)蔥白中蒜氨酸酶的活力都有不同程度的抑制作用，特別是Fe3＋對(duì)蒜氨酸酶的抑制力達(dá)到了82．5%，Cu2＋和Zn2＋的抑制作用分別為77．3%和46．4%；而Ca2＋則表現(xiàn)出對(duì)蒜氨酸酶的激活作用，可以提高蒜氨酸酶的活力達(dá)133%。

3．5 不同滅活條件對(duì)蒜氨酸酶活力的影響 從圖5中可以看出，微波，甲醇及高溫這3種處理方式對(duì)蔥白中蒜氨酸酶都有較好的滅火作用，其中滅活作用最明顯的是微波處理方式，滅活率接近100%。其次分別為甲醇溶解處理和高溫處理方式，滅活率分別為87%和80%。

圖5 不同滅活條件對(duì)蒜氨酸酶活力的影響Fig 5 Effects of different inactivated ways on the activity of alliinase

4 討論

酶的催化活性與環(huán)境的溫度以及pH值有著密切關(guān)系。Mazelis等［11］在研究大蒜中蒜氨酸酶的性質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，在用磷酸鹽作為緩沖液時(shí)，該酶的最適pH 值為6．6～6．7；郭娟等［12］對(duì)洋蔥中蒜氨酸酶的性質(zhì)研究結(jié)果表明，洋蔥中該酶在pH5～8范圍內(nèi)有較高的活力，pH6．0時(shí)活性最高。而該實(shí)驗(yàn)的蔥白中蒜氨酸酶在pH6．0～8．0范圍內(nèi)有較高的活性，pH6．2時(shí)活性最高。說明蔥白中的蒜氨酸酶與大蒜和洋蔥中的同類酶有一定的差異，而且在反應(yīng)底物方面也有不同。

酶促反應(yīng)中溫度的控制也很重要，一般將酶促反應(yīng)的溫度控制在該酶的最適反應(yīng)溫度下，溫度過高容易引起酶的變性而失活。有研究表明［13］，大蒜中蒜氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為30℃。而該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蔥白中蒜氨酸酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，也說明了蔥白和大蒜中的蒜氨酸酶存在著差異。

在研究金屬離子對(duì)蔥白中蒜氨酸酶活力影響的結(jié)果表明，除了Ca2＋對(duì)該酶表現(xiàn)出了激活作用外，其他的Fe3＋、Cu2＋和Zn2＋對(duì)蔥白中的蒜氨酸酶均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。而王丹等［14］對(duì)大蒜中蒜氨酸酶粗提液的特性研究中顯示，Zn2＋可以使大蒜中蒜氨酸酶的活性提高一倍，李燕等［13］的研究結(jié)果則說明了Zn2＋對(duì)新鮮大蒜中蒜氨酸酶的活性有抑制作用。郭娟等［12］對(duì)洋蔥中的蒜氨酸酶的性質(zhì)研究結(jié)果顯示了Cu2＋、Ca2＋和Zn2＋對(duì)酶有不同程度的激活作用，而Fe3＋則表現(xiàn)出抑制作用［12，14］。這些結(jié)果說明，這一類的蒜氨酸酶有離子活性中心，這方面蔥白與大蒜及洋蔥均存在差異，而且同一酶在不同的反應(yīng)底物條件下，離子活性中心的選擇性可能存在差異。

蔥白中的蒜氨酸酶與大蒜和洋蔥中的酶存在著差異，且蔥白中的含硫化合物類活性物質(zhì)的產(chǎn)生又與該酶有密切的聯(lián)系，故對(duì)蔥白中蒜氨酸酶的研究以及對(duì)蔥白的開發(fā)利用有著較為重要的作用。

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