劉麗君，張潔，唐麗，劉躍，黃勇， （．貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽550004；．貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550004）

右旋酮洛芬氨丁三醇（dexketoprofen trometamol），是2－芳基丙酸類非甾體抗炎藥（non－steroidal anti－inflammatory drugs，NSAIDs），臨床主要用于緩解各類疼痛，特別是骨關(guān)節(jié)病痛，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，與酮洛芬相比有更好的吸收及耐受性，為新一代的非甾體抗炎藥［1－2］。溫度敏感性水凝膠為水溶性或親水性的高分子材料，通過一定的化學(xué)交聯(lián)或物理交聯(lián)形成能感知外界環(huán)境溫度微小變化，并產(chǎn)生相應(yīng)物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的變化［3］。殼聚糖－甘油磷酸鈉溫敏凝膠系統(tǒng)近年來被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物醫(yī)學(xué)工程等領(lǐng)域［4］。該系統(tǒng)在低溫低濃度下以液體形式存在，當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到臨界膠凝溫度且溫度敏感型凝膠基質(zhì)濃度達(dá)到臨界膠凝濃度時(shí)迅速發(fā)生相突變，在給藥部位形成半固體凝膠態(tài)，達(dá)到局部給藥后藥物在給藥部位滯留時(shí)間延長(zhǎng)的目的［5］。目前市售的右旋酮洛芬氨丁三醇普通制劑，存在半衰期短，給藥頻繁，胃腸道不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，基于此筆者研制了通過局部（關(guān)節(jié)腔或皮下）注射給藥，避免胃腸道刺激及減少給藥次數(shù)的溫敏凝膠制劑，并考察其體外釋藥行為及釋藥機(jī)制，以期為骨關(guān)節(jié)炎、癌痛患者的臨床治療及藥物控緩釋制劑的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

UV－2401PC型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；THZ－82型水浴恒溫振蕩器（金壇市漢康電子有限公司）；pHs－3C型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；S10－3型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；CQ－250A型超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；CS501A型恒溫槽（重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司）。

右旋酮洛芬氨丁三醇（純度：99．8%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)20110301）；右旋酮洛芬氨丁三醇片（葵拉蘭，湖北安聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號(hào)120703）。殼聚糖（CS，批號(hào)20120117，脫乙酰度：95%，青島海普生物技術(shù)有限公司）；β－甘油磷酸鈉（β－GP，批號(hào) 1141M077V，美國(guó) Sigma公司）；注射用右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏凝膠（貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)20121201，20121202，20121203，規(guī)格：0．25%）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 溫敏凝膠的制備［6］（1）空白凝膠的制備：配制2%CS溶液（0．1 mol·L－1醋酸溶解），真空抽濾，放置于4℃冰箱中待用。配制56% 的β－GP溶液（0．02 mol·L－1氫氧化鈉溶解），置超聲波清洗機(jī)（100功率，6 min）完全溶解后待用。取適量β－GP溶液，緩慢滴加到置于冰浴中的CS溶液內(nèi)，同時(shí)用恒溫磁力攪拌器（1 000 r·min－1，10 min）攪拌均勻，即得均勻透明溶液，并密封置于4℃冰箱中冷藏備用。（2）含藥凝膠的制備：精密稱取一定量的右旋酮洛芬氨丁三醇置量瓶中，注射用水定容至刻度，逐滴加入至已配制并置于冰浴中的β－GP／CS混合溶液內(nèi)，磁力攪拌器（1 000 r·min－1，10 min）攪拌均勻，用0．02 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH7．4，放于4℃冰箱中冷藏備用。制得含有右旋酮洛芬氨丁三醇模型藥的載藥水凝膠。

2．1．1 膠凝過程的測(cè)定 采用試管倒裝法［7］來判斷凝膠的轉(zhuǎn)變。如圖1所示，制備的溫敏凝膠在低溫時(shí)，呈均勻、流動(dòng)的液體狀態(tài)（A），當(dāng)溫度升高至37℃左右時(shí)發(fā)生膠凝轉(zhuǎn)變，先在表面形成一層白色薄膜，再逐漸相變?yōu)槿榘装胪该鞴腆w凝膠（B）。

圖1 溫敏性凝膠的膠凝過程Fig 1 The process of gelation of thermosensitive hydrogel

2．1．2 溫敏凝膠制劑的處方設(shè)計(jì)與優(yōu)化 通過前期預(yù)試驗(yàn)，以凝膠化時(shí)間、凝膠固化成型性為指標(biāo)對(duì)空白凝膠進(jìn)行處方初步篩選，并在此基礎(chǔ)上以凝膠的體外累積釋放度為單因素考察指標(biāo)。以CS、β－GP為原料制備溫敏凝膠載體，對(duì)CS脫乙酰度、β－GP／CS溶液配比進(jìn)行考察，篩選出膠凝溫度接近37℃、pH7．4時(shí)膠凝時(shí)間較短固化成型性較好的方案，即CS脫乙酰度為95%，β－GP／CS溶液配比為1∶2。

2．1．3 溫敏凝膠處方篩選 通過“2．1．2”項(xiàng)下單因素考察得知：藥物水溶液的濃度（A）、CS用量（B）、β－GP／CS溶液配比（C），對(duì)凝膠的體外累積釋放度有較大影響。因此，將其作為3個(gè)影響因素進(jìn)行3水平的L9（33）正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)處方組成。參照中國(guó)藥典2010年版二部附錄XIXD緩控釋制劑指導(dǎo)原則［8］的規(guī)定，采用綜合評(píng)分法，設(shè)定2 h，4 d，8 d的累積釋放度分別以10%，50%，80%為理想值，權(quán)重系數(shù)定為1，以q2 h，q4 d，q8 d與理想值偏差之和（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，即Y＝｜Q2h－10%｜×1＋｜Q4d－50%｜×1＋｜Q8d－80%｜×1，以Y值越小越好，表明釋放度與所定標(biāo)準(zhǔn)越接近［9］。具體因素水平和結(jié)果見表1，表2。

表1 正交因素水平試驗(yàn)表Tab 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of the orthogonal design（n＝6）

將上述結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab 3 Results of analysis of variance on orthogonal test

表4 一致性子集表分析結(jié)果Tab 4 Results of analysis on consistent subset table

通過上述方差分析得出：B、C兩因素具有顯著性差異，且各因素對(duì)指標(biāo)影響的大小次序?yàn)镃＞B＞A；并結(jié)合一致性子集表分析，優(yōu)選得到的處方組成為：A1B3C2。即藥物水溶液濃度為0．002 5 g·mL－1，CS用量為0．04 g，β－GP／CS溶液配比為1∶2。

2．2 體外釋放度考察

2．2．1 波長(zhǎng)的選擇 精密稱取右旋酮洛芬氨丁三醇對(duì)照品，加純化水超聲溶解，稀釋為適當(dāng)濃度的溶液；按處方比例稱取輔料，照上述方法溶解并稀釋，超聲5 min后，用0．8μm微孔濾膜濾過，取濾液，以純化水為空白對(duì)照，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果表明本品在260 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，且輔料在此波長(zhǎng)下無干擾。

2．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取右旋酮洛芬氨丁三醇0．021 3 g，置100 mL量瓶中，并用純化水稀釋超聲溶解至刻度，作為母液。分別量取母液3，2．5，2，1．5，1，0．5，0．2 mL置25 mL量瓶中，稀釋至刻度后，以純化水為空白對(duì)照，在260 nm處測(cè)定其吸收度（A），以濃度（C）對(duì)吸收度（A）作線性回歸，得回歸方程式：A＝0．043 3C＋0．008 4，r＝0．999 9，結(jié)果表明本品在1．70～25．56μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．2．3 精密度試驗(yàn) 取“2．2．2”項(xiàng)下3個(gè)濃度的溶液，于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度（A），24 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算其日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算其日間精密度。

結(jié)果表明：該方法的日內(nèi)、日間精密度良好，所得峰面積RSD均小于2%，符合樣品測(cè)定要求。

2．2．4 加樣回收率試驗(yàn) 按比例加入空白輔料，配制成右旋酮洛芬氨丁三醇濃度分別為完全溶出時(shí)的80%，100%，120%的右旋酮洛芬氨丁三醇溶液，測(cè)定其吸收度（A），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，以測(cè)得量對(duì)加入量計(jì)算回收率。結(jié)果表明，本處方輔料不影響右旋酮洛芬氨丁三醇的測(cè)定，回收率在99．8%～100．6%之間，RSD＜1%，符合測(cè)定要求。

2．2．5 釋放度的測(cè)定方法［6］按“2．1”項(xiàng)下制備3批樣品（批號(hào)20121201，20121202，20121203，規(guī)格：0．25%）放置于玻璃試管內(nèi)，于水浴恒溫振蕩器中預(yù)熱，完全形成凝膠后，加入10 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7．4）為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，溫度（37±0．5）℃，分別于1，2，4，8，12，24，48，72，96，120，144，168，192，216，240，288 h傾盡溶出介質(zhì)，以0．8μm的微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液50μL置5 mL量瓶中，加水稀釋并定容，作為供試品溶液；同時(shí)補(bǔ)加等溫等體積的新鮮PBS溶液。用紫外分光光度法測(cè)定吸收度，并計(jì)算其累積釋放度。

2．3 樣品含量測(cè)定 取3批溫敏凝膠樣品，按“2．2”項(xiàng)下的方法測(cè)定右旋酮洛芬氨丁三醇的含量。結(jié)果，3批樣品中右旋酮洛芬氨丁三醇的標(biāo)示含量分別為98．65%，98．89%，99．90%（n＝3），平均標(biāo)示含量為99．15%。

2．4 溫敏凝膠的制備工藝驗(yàn)證 用“2．2．5”項(xiàng)下的3批樣品，分別測(cè)定其累積釋放度。結(jié)果見圖2。如圖所示3批樣品各批次間差異較小，工藝重復(fù)性良好，含量、溶出較均一。結(jié)果顯示制備的溫敏凝膠在第7天釋放量即達(dá)到70%以上并可持續(xù)釋放至12 d以上，證明本品在體外有很好的緩釋效果。參照中國(guó)藥典2010年版二部附錄XIXD緩控釋制劑指導(dǎo)原則［8］的規(guī)定，制定本品的釋藥范圍1，2 h，4，8 d的釋放度分別為1%～6%，7%～10%，50%～60%和75%以上，均符合規(guī)定。

圖2 3批樣品體外的釋放曲線Fig 2 Cumulative release profiles of three batches of dexketoprofen trometamol sustained－release tablets

2．5 溫敏凝膠與市售片劑的對(duì)比 將優(yōu)化處方后制得的溫敏凝膠與普通市售片劑（葵拉蘭）進(jìn)行體外釋藥對(duì)比，結(jié)果見圖3。如圖所示，溫敏凝膠比葵拉蘭更具有明顯的緩釋效果。

2．6 釋藥機(jī)制的研究分析［10］累積釋放度按下式計(jì)算：F＝Q＋Mt／M∞，F(xiàn)為0～t時(shí)間內(nèi)右旋酮洛芬氨丁三醇的表觀釋放率 （%），Q為右旋酮洛芬氨丁三醇的溶出度（%），Mt／M∞為t時(shí)間右旋酮洛芬氨丁三醇累積釋放百分率（%）［11］。將優(yōu)化處方分別利用 Higuchi模型、Ritger－Peppas模型、Hixson－Crowell模型、零級(jí)方程、一級(jí)方程等釋藥模型對(duì)0～12 d的釋藥行為進(jìn)行擬合。結(jié)果見表5。

圖3 水凝膠與葵拉蘭的體外釋放曲線Fig 3 Cumulative release profiles of dexketoprofen trometamol hydrogels and dexketoprofen trometamol tablets

表5 右旋酮洛芬氨丁三醇體外釋放模型擬合Tab 5 Dexketoprofen tromethamine in vitro released in various models

通過上表的擬合分析結(jié)果得知：右旋酮洛芬氨丁三醇溫敏凝膠的釋藥特性用Ritger－Peppas方程擬合較好，并且釋放指數(shù)n介于0．5～1．0之間，接近0．5，說明該制劑的釋藥機(jī)制為擴(kuò)散和溶蝕的協(xié)同作用，主要以擴(kuò)散為主［12］。

3 討論

在實(shí)驗(yàn)中，由于CS必須酸化后才能變?yōu)殛栯x子聚合物與帶負(fù)電的β－GP結(jié)合，而CS溶解在不同的酸性物質(zhì)后又會(huì)影響到載藥凝膠最終的體外累積釋放度。在前期研究中分別考察CS在磷酸、鹽酸、醋酸中的載藥釋放度，發(fā)現(xiàn)CS在醋酸中的釋放性能較好，在磷酸中稍差。在測(cè)定凝膠溫度時(shí)，升溫的速率及攪拌子的大小、轉(zhuǎn)速的快慢、熱傳導(dǎo)的均勻程度都會(huì)影響到結(jié)果的重復(fù)性，因此實(shí)驗(yàn)中所有樣品的操作均應(yīng)在恒定的條件中進(jìn)行。本研究采用恒溫振蕩法進(jìn)行釋放度實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)釋藥的速率會(huì)隨著振蕩頻率的加快增加，但彼此間的釋藥特性基本相同，為了能更好地模擬體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境選用100 r·min－1的頻率。

我們以CS、β－GP為凝膠載體，研制了具有緩釋性能的可局部注射用的溫敏凝膠，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的處方工藝制備3批溫敏凝膠，體外累計(jì)釋放重復(fù)性及均一性均良好，說明本制劑制備工藝穩(wěn)定、重復(fù)性好。并且，釋放度的測(cè)定符合漏槽條件。本品與市售片劑“葵拉蘭”進(jìn)行體外釋藥對(duì)比研究，證明溫敏凝膠更具有緩釋的特性。實(shí)驗(yàn)累積釋放度結(jié)果通過數(shù)學(xué)模型擬合，發(fā)現(xiàn)本制劑的釋藥行為符合Ritger－Peppa方程，為擴(kuò)散和溶蝕的協(xié)同作用，這可能是凝膠基質(zhì)、原料藥及處方工藝對(duì)它的影響。

β－GP／CS溫敏凝膠體系是一類對(duì)環(huán)境溫度刺激具有較高響應(yīng)的高分子材料，亦是一種新型的給藥傳遞系統(tǒng)［13］。本實(shí)驗(yàn)將右旋酮洛芬氨丁三醇與凝膠均勻混合后制成一種在體外（溫度低于36℃）時(shí)呈液態(tài)，而在體內(nèi)（溫度37±0．5℃）時(shí)呈固態(tài)的載藥凝膠。該制劑不僅可以準(zhǔn)確定位于病發(fā)部位，使藥物通過注射到達(dá)人體病變部位，發(fā)揮靶向制劑的作用，而且還可維持體內(nèi)的血藥濃度，降低不良反應(yīng)，減少給藥次數(shù)和血藥濃度的波動(dòng)，使其發(fā)揮緩釋和局部起效的作用，尤其是對(duì)關(guān)節(jié)及癌痛部位的給藥起到長(zhǎng)時(shí)間治療的效果［14－15］。并且，該制劑還具有高效、長(zhǎng)效等特點(diǎn)，將擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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