吳素珍，李加林，陳水親，朱秀志 （．贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州34000；．贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州34000）

當(dāng)歸是臨床使用最多的中藥之一，素有“十方九歸”之稱。當(dāng)歸多糖是其發(fā)揮藥效的主要成分之一，是一類重要的生物大分子物質(zhì)，能提高機(jī)體的免疫功能，具有防衰老，抗氧化、抗癌、抗病毒等作用［1］。

研究發(fā)現(xiàn)硫酸多糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用［2］。其抗病毒和抗腫瘤活性引起了人們的極大重視。除了天然的硫酸酯化多糖，許多原本不具有或僅有微弱抗病毒或抗腫瘤活性的多糖，經(jīng)過硫酸酯化修飾后其抗病毒或抗腫瘤活性得到了顯著提高，而且由于其抗病毒或抗腫瘤的同時(shí)還能提高機(jī)體的免疫功能，成為具有良好開發(fā)前景的藥物［3］。本實(shí)驗(yàn)采用氨基磺酸－甲酰胺法制備硫酸酯化當(dāng)歸多糖，比較研究了硫酸酯化前后當(dāng)歸多糖抗腫瘤活性的變化，為當(dāng)歸多糖的抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1．1 儀器與試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號(hào)NYA0784）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)070611）；噻唑藍(lán)（MTT，Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；透析袋 （截留分子量7 000）；CO2培養(yǎng)箱、MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；WF－4000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯微波化學(xué)技術(shù)有限公司）；傅立葉紅外光譜儀（美國nicolet 380）；當(dāng)歸多糖（多糖含量92．3%，分子量為1．4×104Da，本實(shí)驗(yàn)室制備）；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1．2 細(xì)胞株 K562細(xì)胞株由贛南醫(yī)學(xué)院范啟蘭教授惠贈(zèng)，MCF－7細(xì)胞株由贛南醫(yī)學(xué)院向明鈞副教授惠贈(zèng)。

1．3 藥材 當(dāng)歸藥材購自贛州市鑫龍欣大藥房，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室李加林副教授鑒定為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸（Angelicasinesis（Oliv．）Dieis）的干燥根。

2 方法

2．1 當(dāng)歸多糖的制備 稱取一定量的干燥當(dāng)歸粉末，加入適量純化水在熱水浴中浸提，其間不斷攪拌，靜置冷卻后離心，收集上清液，減壓濃縮，在冷卻后的上清液中加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，Sevag法除蛋白，冷凍干燥，得當(dāng)歸粗多糖，取一定量的粗多糖溶于0．1 mol·L－1氯化鈉溶液，過 DEAE－Sephadex A－25 （80 cm×3．5 cm）凝膠柱，用不同濃度氯化鈉梯度洗脫合并相同組分，透析，減壓濃縮，冷凍干燥，得到均一性當(dāng)歸多糖［4］。

2．2 硫酸酯化當(dāng)歸多糖的制備 將當(dāng)歸多糖和氨基磺酸按物質(zhì)的量濃度比（1∶2）混懸于10 mL甲酰胺中，置于微波反應(yīng)釜中，溫度控制在50℃，功率800 W，反應(yīng)5 min。冷卻至室溫后加入50 mL左右冰水，用2．5 mol·L－1氫氧化鈉調(diào)至中性，加入3倍體積無水乙醇，4℃冰箱中放置過夜，析出沉淀。離心收集沉淀，并將沉淀溶于適量水，流水透析1 d，純化水透析2 d，濃縮后真空干燥得硫酸酯化當(dāng)歸多糖［5］。

2．3 硫酸基含量測(cè)定

2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取硫酸鉀0．181 g，加去離子水定容，充分搖勻。分別吸取2．0，4．0，6．0，8．0，10．0mL溶液。轉(zhuǎn)入100 mL量瓶中，加去離子水定容。充分搖勻，分別吸取5 mL置50 mL比色管中，加5 mL25%二氯化鋇，搖勻，放置10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定400 nm處的吸光度值。以S含量（X）和吸光度（Y）繪制曲線。得 回 歸 方 程：Y＝2．583 51X－0．002 39（R＝0．999 1）。

2．3．2 樣品制備和測(cè)定 精密稱取各硫酸酯化多糖20 mg，加入20% 鹽酸20 mL，煮沸至溶液澄清，稍冷。轉(zhuǎn)入100 mL量瓶中，去離子水定容。吸取5 mL置50 mL比色管中，加入5 mL25%二氯化鋇搖勻，放置10 min，于422 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算硫酸基取代度。

DS＝（1．62×S%）／（32－1．02×S%），其中DS為取代度，S%為硫酸基的含量。

2．4 紅外光譜分析 稱取適量當(dāng)歸多糖、硫酸酯化當(dāng)歸多糖分別與干燥的溴化鉀粉末混勻，置瑪瑙研缽中充分研磨使其混勻，壓片機(jī)壓成均勻透明、無明顯顆粒的片。用同法制成只有溴化鉀的供試片作為空白背景，用紅外光譜儀測(cè)定樣品4 000～400 cm－1的紅外光譜。

2．5 MTT法檢測(cè)硫酸酯化當(dāng)歸多糖的體外抗腫瘤作用 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞（MCF－7）、白血病細(xì)胞（K562），配成濃度為1．0×105／mL的細(xì)胞懸液，以每孔接種細(xì)胞懸液180μL接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖溶液20μL，使當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖的終濃度分別為0．1，0．2，0．4，0．8，1．0，2．0mg·mL－1，對(duì)照組加相同體積的 RPMI1640溶液，每組設(shè)3個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT（5 mg·mL－1）溶液，再培養(yǎng)4 h。小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO溶液，待完全溶解后，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。根據(jù)下面的公式計(jì)算出抑制率，繪制濃度－抑制率曲線。

抑制率（%）＝（1－處理組吸光度／對(duì)照組吸光度）×100%

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理［4］所有數(shù)據(jù)用±s表示，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。多個(gè)樣本均數(shù)與對(duì)照組樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3．1 當(dāng)歸多糖硫酸酯硫酸基含量測(cè)定 根據(jù)硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程Y＝2．583 51X－0．002 39（R＝0．999 1），測(cè)得當(dāng)歸多糖硫酸酯的硫酸基含量為13．69%，硫酸基取代度為1．23。

3．2 當(dāng)歸多糖及硫酸酯化當(dāng)歸多糖紅外光譜分析 當(dāng)歸多糖紅外光譜圖中，在3 400 cm－1處有強(qiáng)峰，顯示有－OH 基團(tuán)；當(dāng)歸多糖在1 600，1 400，1 040 cm－1附近有多糖母體特征吸收峰，說明是多糖。

圖1 當(dāng)歸多糖紅外光譜Fig 1 IR spectrum of Angelica polysaccharide

硫酸酯化多糖不僅在1 600，1 400，1 040 cm－1附近有多糖母體特征吸收峰，同時(shí)還可以看出，硫酸酯化多糖在3 400 cm－1附近的羥基吸收峰有所降低，表示部分羥基已被酯化，在1 240 cm－1左右為S＝O伸縮振動(dòng)，620 cm－1處有硫酸酯鍵的特征吸收峰，證明硫酸基與當(dāng)歸多糖結(jié)合成酯。

圖2 硫酸酯化當(dāng)歸多糖紅外光譜Fig 2 IR spectrum of sulfated Angelica polysaccharide

3．3 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)MCF－7增殖的影響 用不同濃度的當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖處理乳腺癌細(xì)胞（MCF－7）后，可見抑制率均隨著多糖和硫酸酯化多糖濃度的增加而增加；當(dāng)質(zhì)量濃度為2．0mg·mL－1時(shí)，當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì) MCF－7的抑制率分別為41．47%，85．93%，與對(duì)照組相比差異有顯著性；對(duì)MCF－7抑制效果硫酸酯化當(dāng)歸多糖明顯優(yōu)于當(dāng)歸多糖對(duì)其的抑制。結(jié)果見表1，圖3。

表1 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)MCF－7生長(zhǎng)的影響（±s，n＝3）Tab 1 Inhibitory rate of Angelica polysaccharide and sulfated Angelica polysaccharide on MCF－7 cells（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0．05

組別 質(zhì)量濃度／mg·mL－1當(dāng)歸多糖 硫酸酯化當(dāng)歸多糖吸光度 抑制率／% 吸光度 抑制率／%對(duì)照 0．0 0．482 3±0．084 9 － 0．482 3±0．084 9－多 糖 0．1 0．456 4±0．018 7 5．37 0．467 5±0．021 4 3．06 0．2 0．449 8±0．013 2 6．73 0．447 6±0．013 8 7．19 0．4 0．440 3±0．007 8 8．70 0．370 5±0．020 5a23．17 0．8 0．423 0±0．035 8 12．29 0．185 1±0．035 3a61．63 1．0 0．397 4±0．011 7a17．60 0．161 0±0．009 0a66．62 2．0 0．282 3 0．018 8a41．47 0．067 9±0．008 1a85．93

圖3 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)MCF－7作用的濃度－抑制率曲線Fig 3 Concentration／inhibition curve for the effect of Angelica polysaccharide and sulfated Angelica polysaccharide on MCF－7cells

3．4 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)白血病細(xì)胞（K562）增殖的影響 用不同濃度的當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖處理K562后，可見抑制率均隨著多糖和硫酸酯化多糖濃度的增加而增加；當(dāng)質(zhì)量濃度為2．0mg·mL－1時(shí)，當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)K562的抑制率分別為66．62%，77．22%，與對(duì)照組相比差異有顯著性；對(duì)K562抑制效果硫酸酯化當(dāng)歸多糖更為明顯。結(jié)果見表2，圖4。

表2 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)白血?。↘562）生長(zhǎng)的影響（±s，n＝3）Tab 2 Inhibitory rate of Angelica polysaccharide and sulfated Angelica polysaccharide on K562 cells（±s，n＝3）

表2 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)白血病（K562）生長(zhǎng)的影響（±s，n＝3）Tab 2 Inhibitory rate of Angelica polysaccharide and sulfated Angelica polysaccharide on K562 cells（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0．05

組別 質(zhì)量濃度／mg·mL－1當(dāng)歸多糖 硫酸酯化當(dāng)歸多糖吸光度 抑制率／% 吸光度 抑制率／%對(duì)照 0．0 0．943 7±0．038 2 － 0．943 7±0．038 2－多 糖 0．1 0．516 3±0．014 5a45．28 0．455 3±0．029 2a51．75 0．2 0．512 0±0．020 7a45．74 0．316 7±0．038 3a66．44 0．4 0．457 0±0．050 3a51．57 0．309 3±0．024 1a67．22 0．8 0．402 7±0．026 3a57．33 0．304 0±0．020 8a67．79 1．0 0．335 3±0．012 9a64．46 0．256 3±0．029 2a72．84 2．0 0．315 0±0．034 0a66．62 0．215 0±0．022 4a77．22

圖4 當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)K562作用的濃度－抑制率曲線Fig 4 Concentration／inhibition curve for the effect of Angelica polysaccharide and sulfated Angelica polysaccharide on K562 cells

4 討論

癌癥對(duì)人類健康威脅很大，目前的治療方法主要有外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療。放療缺乏特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也損傷正常細(xì)胞，化學(xué)治療又有很強(qiáng)的不良反應(yīng)，因此，尋找天然的低毒高效的抗癌輔助藥越來越重要。

硫酸酯化多糖是多糖的硫酸酯化衍生物，近幾年相繼發(fā)現(xiàn)一些多糖硫酸酯化修飾后抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)，如茯苓多糖、螺旋藻多糖、牛膝多糖等［7－9］經(jīng)硫酸酯化修飾后體內(nèi)和體外抗腫瘤效果顯著提高。

近些年對(duì)多糖硫酸酯的抗腫瘤活性做了不少研究，結(jié)果表明，無論是在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫功能、抗癌轉(zhuǎn)移方面都顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，海藻硫酸多糖和海帶硫酸多糖等天然的硫酸多糖均具有一定的抗腫瘤活性［10］。先宏等［11］發(fā)現(xiàn)，海藻硫酸多糖可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF，增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

前期動(dòng)物體內(nèi)研究表明，硫酸酯化當(dāng)歸多糖能顯著抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性腫瘤的生長(zhǎng)，雖然硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用不及環(huán)磷酰胺，但能顯著增加荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，改善荷瘤小鼠的非特異性免疫功能，能明顯延長(zhǎng)S180腹水瘤小鼠生命存活期。本實(shí)驗(yàn)所用的MTT法具有經(jīng)濟(jì)、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用的體外抗腫瘤藥物篩選方法，選用乳腺癌細(xì)胞株MCF－7和白血病細(xì)胞株K562，用當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖進(jìn)行體外抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明硫酸酯化后的當(dāng)歸多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF－7抑制作用明顯強(qiáng)于未酯化的當(dāng)歸多糖對(duì)其的抑制作用。當(dāng)濃度為2．0mg·mL－1時(shí)，當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)MCF－7的抑制率分別為41．47%，85．93%。硫酸酯化當(dāng)歸多糖的濃度小于0．2 mg·mL－1時(shí)，對(duì) MCF－7的抑制作用與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，可能是因?yàn)榱蛩狨セ?dāng)歸多糖的濃度太低，而對(duì)MCF－7的抑制不明顯。當(dāng)歸多糖的濃度要達(dá)到1 mg·mL－1左右才對(duì)MCF－7的抑制作用有顯著性。硫酸酯化當(dāng)歸多糖對(duì)MCF－7的抑制作用明顯優(yōu)于當(dāng)歸多糖對(duì)其的抑制作用。當(dāng)歸多糖和硫酸酯化當(dāng)歸多糖在低濃度對(duì)K562就有顯著的抑制作用。酯化后的當(dāng)歸多糖對(duì)K562的抑制作用更加明顯，但其作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

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