王 珂

(公安海警學(xué)院，浙江寧波 315801)

0 引言

乙醇的成癮性和濫用是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［1］，近年來(lái)，酒后引起的刑事案件和交通事故案件不斷上升，2011年5月1日《中華人民共和國(guó)刑法修正案(八)》正式實(shí)施，醉酒駕駛作為危險(xiǎn)駕駛罪被追究駕駛?cè)诵淌仑?zé)任。目前，許多國(guó)家都制定了血中乙醇濃度與交通事故責(zé)任認(rèn)定的關(guān)系，因此，血中乙醇檢驗(yàn)在此類案件的審理中至關(guān)重要［2-3］。目前生物樣品中乙醇定量測(cè)定的參考方法為氣相色譜法，但該法儀器昂貴，手續(xù)復(fù)雜不便推廣［4］，而酶法分析中乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)對(duì)乙醇是相對(duì)特異的，不會(huì)與甲醇、丙酮或異丙醇等起催化反應(yīng)，因此準(zhǔn)確度和精密度較高，并且可在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行測(cè)定，速度快，與氣相色譜法相關(guān)性好［5-6］，因此應(yīng)用前景較廣。但由于ADH在酸性(pH低于6.0)或堿性(pH大于8.5)條件下極不穩(wěn)定，并且重金屬和使用的反應(yīng)促進(jìn)劑如氨基脲鹽酸鹽等對(duì)其有明顯抑制作用［5-7］，因此目前該試劑多制成干粉試劑，復(fù)溶后也須盡快使用，無(wú)法滿足實(shí)際檢測(cè)需求。本文對(duì)酶法血乙醇檢測(cè)試劑進(jìn)行了改良并對(duì)相關(guān)性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

維生素C為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào):20101123;中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液(C6-C24)，批號(hào):80DH066，為華瑞制藥有限公司產(chǎn)品;游離膽紅素及結(jié)合膽紅素:購(gòu)于百靈威科技有限公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)K50L19和JH10-4286;血紅蛋白:購(gòu)于上海瑞齊生物科技有限公司，批號(hào):20101203;日立7180全自動(dòng)生化分析儀(日本島津公司);pH數(shù)字式酸度計(jì)FE20(梅特勒-托利多)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)原理

樣本中的乙醇在ADH催化下生成乙醛，同時(shí)將等量的氧化型輔酶Ⅰ(β-NAD)還原成還原型輔酶I(NADH)，在340 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度變化，參照乙醇標(biāo)準(zhǔn)液吸光度變化可計(jì)算出樣本中乙醇濃度。

1.2.2 試劑配制

試劑1:100 mM焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液(pH 9.1)，10 g/L氨基脲鹽酸鹽，1 g/L疊氮鈉;試劑2:100 mM 哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)緩沖液(pH 6.7)，30 mM β-NAD，40 KU/L ADH，1 g/L 牛血清白蛋白(BSA)，0.5 mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)，1 g/L 疊氮鈉。

1.2.3 參數(shù)

終點(diǎn)法，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm(主)，反應(yīng)溫度為37℃ ，樣本用量2μL，試劑1用量200μL，試劑2用量50μL，樣品加試劑1混勻，30～37℃孵育3～5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，30～37℃反應(yīng)5 min后，讀取吸光度A1，ΔA=A1-A0。

1.2.4 試劑成份和濃度對(duì)檢測(cè)性能的影響。

參照文獻(xiàn)［5］和［7］-［9］，考察不同種類及濃度試劑成分對(duì)試劑反應(yīng)靈敏度和穩(wěn)定性影響，以乙醇樣本反應(yīng)前后吸光度的變化率為指標(biāo)。

1.2.5 對(duì)研制的乙醇試劑進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)

試劑的精密度按EP5-A2文件中的方法評(píng)價(jià)［10］:取乙醇高值與低值的混合血清各一份，測(cè)定20次，計(jì)算批內(nèi)精密度。

試劑檢測(cè)線性根據(jù)EP6-A文件中的方法評(píng)價(jià)［11］:取乙醇高、低值血清樣本各一份。將高值和低值血清分別按不同比例混合稀釋成不同濃度梯度的樣本，并將這些樣本隨機(jī)排列進(jìn)行測(cè)定，各個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，取其均值為測(cè)定值，與實(shí)際值做線性對(duì)比。

方法學(xué)對(duì)比實(shí)驗(yàn)按照EP9-A2文件中的方法評(píng)價(jià)［12］:選擇不同濃度的乙醇樣本40份，分別用本試劑及申能-德賽試劑對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

樣本中共存的干擾成分可導(dǎo)致患者檢測(cè)結(jié)果與真值間偏離，影響對(duì)結(jié)果的判斷，因此驗(yàn)證和確認(rèn)干擾，明確干擾物質(zhì)引起的結(jié)果差異，越來(lái)越受到關(guān)注，本研究按EP7-A2文件對(duì)改良酶法乙醇測(cè)定試劑抗干擾性能進(jìn)行評(píng)價(jià)［13］:將血清標(biāo)本分為兩份，第一份按9:1比例加入生理鹽水，第二份按同樣比例加入血樣本中常見(jiàn)的干擾物溶液［5-6］，然后將第一份作為第1管，第二份作為第 5 管，將兩者分別按 3∶1、2∶2、1∶3混合作為第2、3、4管，用試劑分別測(cè)定3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以相對(duì)偏差≥10%作為有明顯干擾的評(píng)判指標(biāo)。

試劑熱穩(wěn)定性通過(guò)將試劑置于37℃水浴，分別于水浴前及水浴7天后測(cè)定，采用同一份高濃度乙醇樣本進(jìn)行檢測(cè);試劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性通過(guò)將試劑置于2 ～8 ℃，分別于第0、1、3、6、9、12 個(gè)月進(jìn)行測(cè)定，采用同一份高、低濃度乙醇樣本進(jìn)行檢測(cè);試劑開口穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)通過(guò)將試劑定標(biāo)后，開口放置于生化分析儀的試劑倉(cāng)，分別在開口 1、4、7、15、21、30 天，選用高、低兩種濃度的乙醇樣本，比較開口前后的檢測(cè)結(jié)果偏差。

2 結(jié)果

2.1 試劑配方優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 試劑R1緩沖體系及pH選擇

參照文獻(xiàn)［7］和［8］，分別制備100 mmol/L焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液作為試劑R1的緩沖液，pH均為9.0，試劑中其他成份相同，觀察反應(yīng)靈敏度，發(fā)現(xiàn)焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液反應(yīng)靈敏度較好，而Tris-HCl緩沖液反應(yīng)速率較慢，因此選擇焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液，然后將焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液配成pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，結(jié)果發(fā)現(xiàn) pH 為 9.0 靈敏度最高。因此選擇pH 9.0焦磷酸鈉-甘氨酸緩沖液為R1緩沖體系。

2.1.2 試劑R2緩沖體系及pH選擇

由于β-NAD在酸性條件下較穩(wěn)定，而ADH在中性及弱堿性條件下反應(yīng)性能佳，因此我們選用近中性的緩沖液。分別制備100 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液和PIPES緩沖液作為試劑R2的緩沖液，pH均為7.0，觀察靈敏度和試劑的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在反應(yīng)靈敏度上無(wú)差異，但PIPES緩沖液配制的試劑穩(wěn)定性較好，因此選擇 PIPES緩沖液，然后將PIPES 緩沖液配成 pH 6.5、6.7、7.0、7.2、7.5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH為6.7靈敏度最高。因此選擇pH 6.7的PIPES緩沖液為R2緩沖體系。

2.1.3 反應(yīng)促進(jìn)劑的種類及其濃度的選擇

參照文獻(xiàn)［5］和［9］，我們分別加入5 g/L氨基脲鹽酸鹽和鹽酸肼于R1試劑中作為反應(yīng)的促進(jìn)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入氨基脲鹽酸鹽對(duì)反應(yīng)促進(jìn)作用較大，因此選擇氨基脲鹽酸鹽作為反應(yīng)促進(jìn)劑，進(jìn)一步我們分別加入濃度為5、10、15、20、25 g/L 的氨基脲鹽酸鹽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 g/L的氨基脲鹽酸鹽靈敏度最高。

2.1.4 β-NAD 濃度的選擇

分別 制 備 β-NAD 濃 度 為 10、20、30、40、50 mmol/L的試劑R2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著β-NAD濃度的升高，試劑靈敏度也升高，但升至30 mmol/L以上時(shí)，靈敏度變化不大，故選用30 mmol/L的濃度。

2.1.5 EDTA-2Na 濃度的選擇

分別制備 EDTA-2Na 濃度為 0.00、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L 的試劑 R2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng) EDTA-2Na濃度在0.5 mmol/L以上時(shí)，試劑較穩(wěn)定，故選用0.5 mmol/L的濃度。

2.1.6 乙醇脫氫酶濃度及保護(hù)劑的選擇

分別制備含濃度為 10、20、30、40、50 KU/LADH的試劑R2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度在40 KU/L以上時(shí)，試劑靈敏度較好，故選用40 KU/L的濃度。參照文獻(xiàn)［12］，選用 1 g/L BSA、半胱氨酸、谷胱甘肽為ADH保護(hù)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含BSA的試劑R2穩(wěn)定性最好，因此選擇BSA作為ADH的穩(wěn)定劑。

2.2 分析特性實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 精密度

對(duì)乙醇高、低值混合樣本重復(fù)測(cè)定20次，結(jié)果顯示，其批內(nèi)變異系數(shù)分別為 0.7%和1.6%(見(jiàn)表1)。

表1 批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 線性范圍

通過(guò)對(duì)不同濃度乙醇混合樣本測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，該試劑的線性范圍評(píng)估相關(guān)方程及相關(guān)系數(shù)分別為 Y=1.024 7X-0.017 1 和 R2=0.999 1(濃度范圍為0 ～2.5 g/L)。

2.2.3 方法學(xué)對(duì)比實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，本試劑(Y)與申能-德賽試劑(X)的樣本測(cè)定結(jié)果比較，Y=1.022 6X-0.034 3，R2=0.998 4;

2.2.4 抗干擾性能

檢測(cè)結(jié)果表明，344μmol/L結(jié)合膽紅素，2.2 mM維生素C，26 mM甘油三酯，5 g/L血紅蛋白，25.2 mM肌酐，134 mM葡萄糖，390 mM尿素對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾。

2.2.5 穩(wěn)定性

將試劑放置于37℃水浴中，用水浴前及水浴7天后的試劑測(cè)定同一份高濃度乙醇混合樣本，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試劑熱穩(wěn)定性結(jié)果

將試劑放置于2～8℃保存，分別于第0、1、3、6、9、12個(gè)月測(cè)定同一份高、低濃度乙醇樣本，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，其檢測(cè)結(jié)果偏差小，試劑穩(wěn)定性較好。將試劑在檢測(cè)儀器上開口不定標(biāo)檢測(cè)樣本值，結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，其檢測(cè)結(jié)果偏差小，開口穩(wěn)定性較好，為臨床檢測(cè)的實(shí)際工作提供了方便。

圖1 試劑長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

圖2 試劑開口穩(wěn)定性結(jié)果

3 討論

血乙醇檢測(cè)是法醫(yī)毒化分析中的一項(xiàng)基本工作，在酒后駕車、中毒死亡等案件的鑒定中也至關(guān)重要［3］。本研究通過(guò)加入合適濃度的 ADH保護(hù)劑BSA及重金屬螯合劑EDTA-2Na，并選擇pH 6.7的PIPES作為緩沖液，使ADH在此條件下2～8℃至少可以穩(wěn)定1年，并參照文獻(xiàn)［5］和［7］在R1中添加甘氨酸來(lái)解除產(chǎn)物乙醛及反應(yīng)促進(jìn)劑氨基脲鹽酸鹽對(duì)ADH的抑制作用。按本研究制備的酶法乙醇試劑，測(cè)定高低值濃度樣本的批內(nèi)精密度CV值分別為 0.7% 和 1.6%，線性范圍可達(dá) 2.5 g/L，與申能-德賽試劑比較 R2為0.998 4，344μmol/L 結(jié)合膽紅素，2.2 mM 維生素 C，26 mM 甘油三酯，5 g/L血紅蛋白，25.2 mM 肌酐，134 mM 葡萄糖，390 mM 尿素對(duì)檢測(cè)結(jié)果均無(wú)干擾，試劑抗熱能力強(qiáng)，2～8℃儲(chǔ)存至少可穩(wěn)定一年，可滿足樣本檢測(cè)需求。

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