羅艷，謝作明，周義芳，王焰新，甘義群

中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，武漢430074

砷是一種無色無味的劇毒物質(zhì)，在極低濃度下就有很高的致毒性。砷污染已經(jīng)成為全世界面臨的最主要的環(huán)境問題之一。亞洲是地下水砷污染最為嚴重的地區(qū)，砷污染主要分布在孟加拉國、印度和中國[1]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定飲用水中砷的最高濃度為10 μg·L-1[2]。在世界范圍內(nèi)，由于長期飲用高砷地下水而導(dǎo)致砷中毒的事件已多有報道。長期暴露在高砷環(huán)境下，人體健康會受到威脅，高砷環(huán)境還會使皮膚角質(zhì)化，甚至誘發(fā)皮膚癌和胃腸道癌，并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3-4]。

我國地下水砷含量超標(biāo)地區(qū)遍及山西、內(nèi)蒙古、新疆、寧夏和臺灣等地[5-9]。近年來，江漢平原地區(qū)出現(xiàn)的砷中毒現(xiàn)象引起了研究者的重視[10-11]。微生物對地下水中的砷的形態(tài)和分布特征都有重要影響，所以研究地下水系統(tǒng)中的細菌多樣性有助于研究砷的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的方法為研究微生物的多樣性提供了有效的手段，尤其是16S rDNA 克隆文庫技術(shù)，該方法重復(fù)性好，攜帶的信息量大，應(yīng)用廣泛。然而目前很少有研究者開展耐砷基因文庫方面的工作，通過構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫，可以分析和研究環(huán)境中的細菌多樣性和種群結(jié)構(gòu)差異以及得到一些有砷抗性的微生物的序列。越來越多的研究表明[12-15]，砷代謝微生物廣泛參與了砷的地球化學(xué)循環(huán)，影響著環(huán)境中砷的地球化學(xué)行為。微生物對不同價態(tài)砷的溶解、遷移和利用的差異影響著砷形態(tài)的轉(zhuǎn)化，表明了微生物在砷的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[16]。

本研究以仙桃沙湖高砷地區(qū)的土壤為例，運用16S rDNA 克隆文庫方法分析土壤細菌多樣性，并確定優(yōu)勢種群，對微生物的群落結(jié)構(gòu)進行了初步分析。本研究可為江漢平原高砷地下水系統(tǒng)中微生物的群落組成和多樣性提供一定的參考信息。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 土壤樣品的采集

采樣地點為湖北省仙桃市沙湖鎮(zhèn)某農(nóng)戶家門前的空地上，海拔18 m，位于30°9.393'N，113°40.655'E。在該地方打1 個50 m 的鉆井，取埋深分別為9.9 ～10.1 m、15.7 ～16.0 m 的2 個土樣放入凍存管中，再將凍存管放入-196℃液氮中保存。

1.2 土樣中的As 含量

將埋深為9.9 ～10.1 m、15.7 ～16.0 m 的2 個土樣分別編號為5 和7。分別準(zhǔn)確稱取5 號和7 號土樣(50±1)mg 采用HNO3和HF 高溫高壓法消解土樣，所用HNO3和HF 均為高純，由市售分析純HNO3和HF 蒸餾提純制得。用質(zhì)量分數(shù)為2%的HNO3稀釋定容，最后用雙道原子熒光分光光度計(AFS-930，北京吉天儀器有限公司)測定砷的濃度。5 號樣和7 號樣中的砷的濃度分別為為30.12 和30.27 μg·g-1。

1.3 16S rDNA 分析

總DNA 模板提取:稱取0.2 ～0.5 g 土樣，加1 mL buffer SLX Mlus 振蕩3 ～5 min，加100 μL bufffer DS并振蕩混合，90℃水浴10 min，3 000 r·min-1離心3 min，去上清液并且加入270 μL buffer sp2 振蕩混合。4℃、3 000×g 下離心10 min，沉淀DNA，加200 μL Elution Buffer 65℃水浴20 min，溶解DNA。加50 μL HTR Reagent，13 000×g 下離心2 min，取上清液，加入等體積的XP2 Buffer，振蕩混勻。全樣加入到Hibind DNA 柱子中，10 000×g 下離心1 min，棄掉直流液，再加入300 μL XP2 Buffer 10 000×g 下離心1 min，用700 μL 的spw wash buffer 進行清洗2 遍，棄掉廢液，加入60 μL 的Elution buffer 65℃水浴15 min，13 000×g下離心1 min，洗提DNA。

目的基因片段的PCR 擴增:選擇通用引物27F(5'-AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3')1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR 反 應(yīng) 體 系(50 μL):dNTP 混合物(2.5 mmol·L-1)4 μL;10×PCR buffer,PCR 擴增條件為:預(yù)變性溫度94℃，5min;變性溫度94℃，30s;退火溫度55℃，1 min;延伸溫度72℃，2 min;36 個循環(huán)后，72℃，延伸10 min。

16S rDNA 連接、轉(zhuǎn)化和文庫構(gòu)建:將PCR 擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化目標(biāo)條帶。純化后與PMD19-T 載體連接，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)過夜。用X-gal 進行藍白斑初步篩選，篩選具有氨芐青霉素抗性的陽性白色轉(zhuǎn)化子，用無菌牙簽挑取白色克隆子轉(zhuǎn)接于LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中于恒溫37℃搖床中培養(yǎng)4 ～5 h 后再做擴增，剔除假陽性克隆子，擴增引物為RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')M13-47 (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')。擴增條件為預(yù)變性溫度94℃，10 min;變性溫度94℃，30 s;退火溫度53℃，30 s;延伸溫度72℃，30 s;25 個循環(huán)后，72℃，延伸5 min。將陽性克隆子送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。結(jié)果用MEGA5 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，構(gòu)建16S rDNA克隆文庫。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 樣品總DNA 提取和PCR 擴增結(jié)果

選取埋深分別為9.9 ～10.1 m、15.7 ～16.0 m 的2 個沉積物土樣，分別提取了總DNA，且以其為模板進行16S rDNA 全長PCR 擴增，得到約1 500 bp大小的片段，回收純化后電泳檢測結(jié)果見圖1。

圖1 DNA 的PCR 產(chǎn)物電泳圖注:M，DL2000;3 ～7，DNA 樣品。Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of DNA

2.2 土樣的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析

挑取5 號樣(9.9 ～10.1 m)中的陽性克隆子進行測序，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 比對，后建立NJ(neighbor joining)進化樹。從圖2 可以看出，根據(jù)同源性可信度高低由NJ 進化樹可將定屬或定種的56 個菌株主要分為4 大類，伯克氏菌目(Burkholderiales)是文庫中最大的細菌菌群，在文庫中占39.29%，其次分別是假單胞桿菌目(Pseudomonadales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)，在文庫中所占比例分別為37.50%和27.78%，乳桿菌目(Lactobacillales)是文庫中最小的細菌菌群，在文庫中占8.33%。

挑取7 號樣(15.7 ～16.0 m)中的陽性克隆子進行測序，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，之后建立NJ 進化樹。從圖3 可以看出，根據(jù)同源性可信度高低由NJ 進化樹可將定屬或定種的78 個菌株主要分為4 大類，伯克氏菌目(Burkholderiales)是文庫中最大的細菌菌群，在文庫中占38.46%。其次分別是腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞桿菌目(Pseudomonadales)，分別占文庫的24.36%和23.08%。放線菌目(Actinomycetales)是文庫中最小的細菌菌群，在文庫中占14.01%。

其中，在假單胞桿菌目中的不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)分別占23.21% 和14.29%，它們都是高耐砷的菌屬。5 號樣中的不動桿菌屬和假單胞菌屬分別占23.21%和14.29%，7 號樣中的不動桿菌屬和假單胞菌屬分別占6.41%和16.67%。

將不同深度的5 號樣和7 號樣的測序結(jié)果進行對比可知，伯克氏菌目、假單胞桿菌目和腸桿菌目在文庫中所占的比例最大。這3 個菌目構(gòu)成了高砷系統(tǒng)中抗砷的優(yōu)勢菌群。它們都屬于變形菌門，變形菌門根據(jù)rRNA 序列被分為5 個綱，用希臘字母α、β、γ、δ 和ε命名。伯克氏菌目屬于β-proteobacteria，假單胞桿菌目和腸桿菌目屬于γ-proteobacteria。目前可知γ-proteobacteria 是仙桃沙湖地區(qū)高砷地下水沉積物中耐砷微生物的主要類群。陳雙喜和邵宗澤[17]在西南印度洋中脊深海沉積物中篩選到了8 株砷抗性菌，它們都屬于γ-proteobacteria。γ-proteobacteria 類群在環(huán)境砷元素的生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要角色。伯克氏菌目(Burkholderiales)可以在某種條件下減少As(V)向As(Ш)的轉(zhuǎn)化[18]。伯克氏菌目(Burkholderiales)中的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)是一種砷氧化反硝化細菌，目前研究者已將其從不同的受砷污染的湖泊、土壤、原始的沉積物及土壤中離了出來[19-22]。假單胞桿菌目中的不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)具有較強的抗性。Turpeinen 等[23]采用磷酸-脂肪酸分析(PLFA)法和16S rRNA 末端限制性片段多態(tài)性分析(t-RFLP)法研究了砷、鉻和銅復(fù)合污染土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)僅有不動桿菌屬和假單胞菌屬的數(shù)量和活性增強。假單胞桿菌目中的不動桿菌屬和假單胞菌屬長期生活在砷脅迫環(huán)境下，通常具有砷抗性，它們是可將高毒性的As(Ш)氧化為低毒性的As(V)的細菌。在腸桿菌目(Enterobacteriales)中有很多“鐵細菌”，它們是一種能使Fe(Ⅱ)氧化成Fe(III)并從中得到能量的一群菌落，如銹鐵菌屬和纖毛鐵細菌屬等。在水中能使亞鐵化合物氧化，并使之生成三價的氫氧化鐵沉淀。在含水層沉積物中鐵的氧化物和氫氧化物是砷的最重要的吸附劑[24]?！拌F細菌”氧化水中溶解的Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)形成不溶產(chǎn)物:氧化鐵或氧化錳，并覆蓋在過濾介質(zhì)上形成天然(生物)吸附層。近年來，也有研究表明[25-26]，微生物能利用鐵的多種礦物質(zhì)，并還原其中的鐵氧化物或氫氧化物，砷隨之被釋放出來。在5 號樣中出現(xiàn)了乳桿菌目，而在7 號樣中卻沒有發(fā)現(xiàn)。乳桿菌目鏈球菌科鏈球菌屬，是革蘭氏染色陽性細菌，是一種營養(yǎng)要求較高的兼性厭氧或厭氧的菌種。在7 號樣中出現(xiàn)了放線菌目，在5 號樣中卻沒有找到。放線菌目，革蘭氏染色陽性，不抗酸，不能運動，大部分嫌氣或兼性嫌氣，少數(shù)好氣或兼性好氣，大多為發(fā)酵型，少數(shù)為氧化型。5 號樣和7 號樣中出現(xiàn)的微生物的不同可能與土樣的深度和砷的濃度有關(guān)。

圖2 5 號樣的NJ 進化樹Fig.2 NJ evolutionary tree of sample No.5

圖3 7 號樣的NJ 進化樹Fig.3 NJ evolutionary tree of sample No.7

本研究對在江漢平原高砷地下水系統(tǒng)中的兩個不同埋深沉積物樣提取了土壤總DNA，并且構(gòu)建了16S rDNA 克隆文庫，結(jié)果可知伯克氏菌目、假單胞桿菌目和腸桿菌目構(gòu)成了高砷系統(tǒng)中抗砷的優(yōu)勢菌群。由于研究只選取了2 個埋深的土壤，不能代表整個地下水系統(tǒng)，但是卻為研究江漢平原高砷地下水系統(tǒng)中的微生物群落組成和多樣性提供一定的參考信息。同時，通過分子生物學(xué)篩選出一些砷抗性菌群，可以考慮利用這些優(yōu)勢菌群來修復(fù)砷污染的土壤和地下水。微生物種類繁多，代謝方式多樣，抗砷機理也不同，而目前對抗砷微生物種類研究由于環(huán)境條件的限制而有限，甚至有的抗砷機理還需完善，因而還需開展大量研究。在分子生物學(xué)水平研究砷污染環(huán)境中的微生物種群多樣性，能夠為研究砷的毒理效應(yīng)以及砷對生態(tài)的影響提供一定的參考。同時如何將不同環(huán)境的水文地球化學(xué)條件與微生物研究聯(lián)系起來，來探討砷的生物地球化學(xué)循環(huán)也是一個難點問題。應(yīng)用性更廣泛的是:找到合適微生物資源，探索更合適、有效的原位修復(fù)技術(shù)來達到除砷目的也是目前的熱點問題。

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